桑树DREB基因家族生物信息学分析及功能研究
自然条件下，植物在整个生命周期中经常遇到多种胁迫，其中干旱、高温、低温和高盐等非生物胁迫是影响和限制植物生长发育的主要因子，甚至会导致植物的死亡，从而严重影响农林业生产效益。因此，非生物胁迫响应的相关基因研究具有重要理论和现实意义。
转录因子作为基因上游的调控因子，在植物的抗逆性方面起着重要作用，其可以激活多种胁迫相关的调控及功能基因的表达，在提高植物抗逆性方面比单一的功能基因更为有效。目前，植物中研究的比较多的逆境相关的转录因子主要有MYB、WRKY、bZIP、AP2/ERF和NAC五大类。AP2/ERF类转录因子作为与胁迫相关的一大类转录因子，根据其结构特点又分为AP2、ERF、DREB、RAV和其他等五个亚家族，其中DREB(Dehydrationresponsiveelementbinding)类转录因子是AP2/ERF家族中与干旱、高温、低温等逆境胁迫相关的植物特有的一类转录因子，其可以特异的与DRE(Dehydrationrespossiveelement)元件相结合，调控启动子中含有DRE元件的基因的表达，能整体性的提高植物的抗逆性，因此，DREB类转录因子的研究受到广泛的关注。但是，目前关于DREB类转录因子的研究主要集中在草本植物中，而在木本植物的研究鲜有报导。
桑树(MorusL.)属多年生双子叶木本植物，从南纬10°到北纬50°都有分布。我国是世界桑树的主要起源地，是世界上桑种质资源最多的国家。桑树对脆弱环境的抗逆性极强，具有耐涝、耐干旱、耐贫瘠、发根力强、生长迅速等特点，且桑叶对二氧化硫、氟化氢、氯气等污染物有很强的耐受性和吸收净化能力，是一种优良的生态经济树种。但是，目前关于桑树抗逆性方面的研究并不多见，关于桑树DREB转录因子的研究更是未见报道，因此，对桑树中DREB类转录因子的研究将有助于补充完善DREB类转录因子在木本植物研究的不足，进一步探究和完善DREB类转录因子的逆境调控机理。本研究通过生物信息学的方法对川桑基因组数据中的30条DREB蛋白序列进行序列分析、克隆，并以湖桑为材料对其中的20个基因进行了高温、低温、干旱和高盐胁迫四种胁迫诱导表达分析，对响应干旱和高盐的基因MnDREB4G进行克隆，构建表达载体并转化到拟南芥中进行功能研究。本研究的主要结果如下:
1.川桑DREB基因家族生物信息学分析
采用生物信息学分析方法，从川桑数据库中分析得到110个含有AP2结构域的蛋白序列，其中AP2家族17个，RAV家族3个，ERF家族54个，DREB家族30个，其他类6个。根据AP2保守结构域的序列特征，川桑DREB家族又分为6个组，其中A1-A6组所含基因个数为2、5、2、8、8、5，其各个组基因的分布情况与拟南芥相类似。其蛋白的分子量多在20-30KD，等电点在4.78到8.93之间。基因长度多在1000bp以下，并且除了第二组的MnDREB2B，MnDREB2C，和MnDREB2E为多外显子基因外，其他27个基因均为单外显子，这一情况与水稻中的第二组的基因结构存在类似情况，推测川桑第二组的这三个基因也可能存在选择性剪切机制。对上游启动子序列分析发现，川桑DREB基因上游的启动子序列中含有多种胁迫相关的元件。由转录组数据分析发现，30个DREB基因中的27个基因在转录组中存在表达数据，各个组内的基因间表达模式不尽相同，如第六组的MnDREB6B在转录组数据中表达量最高，但是MnDREB6E在各个组织中却很低。
2.桑树DREB基因胁迫诱导表达分析
以川桑DREB基因序列为依据设计RT-PCR引物，从湖桑cDNA中筛选得到20对可用引物，对筛选得到的对应的20个基因进行高温、低温、干旱、高盐胁迫处理，发现不同组基因对不同胁迫具有不同的响应，且与其上游启动子序列中含有的胁迫元件不存在必然的关系。推测川桑中由DREB转录因子介导的对非生物胁迫的响应机制可能更为复杂，需要多个基因的相互作用，也可能是川桑中的启动子序列与湖桑中对应的启动子序列存在差异，以湖桑为材料进行的胁迫处理结果不能完全代表川桑中相应基因对胁迫的响应机制。
3.MnDREB4G的功能研究
成功构建MnDREB4G转基因拟南芥株系，对14号、29号、32号转基因株系中的胁迫相关的下游基因rd17、LEA14和rd29A的表达量进行分析发现，rd17和rd29A基因在转基因拟南芥中的表达量上调，且和目的基因MnDREB4G的表达模式相一致，表明MnDREB4G基因对rd17和rd29A的表达起到促进作用，且促进作用与MnDREB4G基因的表达量成正相关;而LEA14基因的表达量在转基因拟南芥中表现出轻微的下调，且在三个转基因株系中的表达量基本上一致，表明LEA14基因的表达量受MnDREB4G的抑制，但不存在效应关系。对转基因植株进行非生物胁迫处理发现，转基因拟南芥对低温和高盐的抵抗力提高，表明MnDREB4G基因可参与植物对低温和高盐胁迫的应答。
桑树;DREB基因;生物信息学;基因表达;功能分析
西南大学
硕士
遗传学
赵爱春
2013
中文
S888.2
102
2013-10-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）