大花红景天UDPGT基因克隆及发根对不同诱导子的响应
大花红景天（Rhodiolacrenulata）是蔷薇目景天科(Crassulaceae)红景天属(RhodiolaL.)多年生草本植物，具有肉质匍匐根状茎，为珍稀药用植物，因花、根、茎之浸出液均为红色而得名，主要生长于西藏高原海拔4500米以上的严寒、缺氧、强日照、无污染地带，是红景天中的极品，大花红景天中红景天苷、酪醇、酮等药用成分的含量是其他红景天品种的5倍，被誉为“雪域人参”。其主要次生代谢产物红景天苷具有抗辐射、抗衰老、抗缺氧、抗疲劳、抗肿瘤及改善心血管系统的作用，是一种具有很大发展前景的适用于特殊地区开发的环境适应性药物。但天然药源植物红景天的野生资源数量锐减，且红景天苷含量较低(0.5％～4.1％，DW)，其产量远远不能满足市场的需求。化学合成红景天苷成本高、毒性大，所以不能应用于规模生产。近年来，随着大花红景天中红景天苷生物合成途径相关酶基因的克隆，利用基因工程手段提高红景天苷含量成为有效途径之一。
本研究采用RACE技术从大花红景天中首次克隆获得了红景天苷合成途径中的尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶(UDP-glucosyltransferase，UDPGT)基因，命名为RcUDPGT(GenBank登录号:JX228125)，并进行了相应的生物信息学分析。分析结果表明，cDNA全长1524bp，其中包含一个长度为1353bp的CDS，编码含有450个氨基酸残基的蛋白。RcUDPGT与其他植物的UDP-葡萄糖基转移酶的同源性较高，与来源于植物、动物、细菌的UDPGTs在发育进化树上聚为3支，RcUDPGT与亲缘关系较近的高山红景天UDPGT聚为一支。该基因所编码的蛋白为亲水性蛋白且定位于细胞质中，二级结构预测RcUDPGT由36.67％α-螺旋、14.67％β-片层和48.67％随意卷曲构成。三级结构预测该基因编码的蛋白具有UDPGT功能结合位点。
利用hiTAIR-PCR技术克隆获得UDIGT基因的基因组DNA序列，结果表明RcUDPGT基因的DNA（登录号为:JX228126）编码区域中存在一个82bp的内含子序列。启动子分析表明在第1354～1404bp处存在可能的基础启动子区域分值为0.97，其上游区域可能存在光响应、厌氧响应、热响应、低温响应、压力与防御响应和花色素苷合成响应元件等。
建立了大花红景天发根诱导及悬浮培养体系。使用1/2MS+0.2mg/L6-BA的培养基中能够高效的获得质地蓬松、生长迅速且无向地性的优良发根。最佳悬浮培养体系为1/2MS液体培养基，20℃，110rpm黑暗培养。并应用SPSS绘制拟合生长曲线并得到生长动力学Logistic方程为y=2.667/(1+839.79e-0.301t)。得到拐点湿重A/2=1.33g，拐点天数(lnB)/k=22.36天，曲线拟合度R2=0.99270。
选用多种诱导子(MeJA，ABA，ASA，SA，UV，Glucose)处理悬浮培养的大花红景天发根，检测红景天苷生物合成途径中的三个关键酶TyDC，PAL和UDPGT的基因表达量，并测定红景天苷含量。结果表明经过SA处理的红景天苷含量是对照的7.63倍，经过MeJA处理后是对照的4.1倍。结合表达量与含量数据分析其相关系数得到RcTyDC与RcUDPGT基因表达量相关系数为0.9957，与红景天苷含量相关系数为0.8754;RcUDPGT基因表达量与红景天苷含量相关系数为0.8572（相关系数＞0.8为具有相关性;相关系数＞0.9为具有显著相关性），表明在苯丙烷代谢途径和酪氨酸脱羧途径中，与红景天苷生物合成最为相关的途径是酪氨酸脱羧途径，SA、MeJA处理大花红景天发根能够显著提高TyDC与UDPGT基因的表达量与红景天苷的含量，并为RcUDPGT启动子存在SA与MeJA顺式作用元件的预测提供有力的证据。组织表达谱(黟DC，PAL和UDPGT)与含量谱的结果表明，TyDC,PAL和UDPGT三个基因的相对表达量均在茎中最高，红景天苷的含量也在茎中最高，其次为叶、花、根。
本研究初步确定了酪氨酸脱羧途径为红景天苷生物合成的主要途径，建立了发根遗传转化体系，并克隆得到UDPGT基因，为今后在大花红景天中研究红景天苷生物合成与代谢工程起到了指示性作用。
大花红景天;尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶;发根诱导;基因克隆;酪氨酸脱羧途径;遗传转化体系
西南大学
硕士
遗传学
廖志华;兰小中
2013
中文
Q949.95;Q943.2
79
2013-10-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）