黄瓜枯萎病菌磷脂酶C4基因的克隆与功能分析
磷脂酶C(phospholipase C，PLC)是磷酸肌醇信号途径中的关键酶。细胞外信号通过细胞膜受体激活磷酸肌醇特异的PLC(Phosphoinositide-specific phospholipase C，PI-PLC)，PLC通过催化磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸(phosphatidylinositol4，5-biphosphate，PIP2)水解产生二酯酰甘油(diacylglycerol，DAG)和三磷酸肌醇(trisphosphate inositol，IP3)。IP3使储存在细胞内钙池中的Ca2+释放出来，DAG和Ca2+直接激活钙调蛋白介导激活的钙离子依赖性蛋白激酶C(Protein kinase C，PKC)。它们作为细胞内的第二信使分子将外界信号转换并传导，引发细胞内的一系列反应。
黄瓜是全球性的重要蔬菜作物，在黄瓜栽培面积逐年扩大和蔬菜的集约化和专业化种植过程中，黄瓜生产上的病害问题显得十分突出，尤其是黄瓜枯萎病等土传病害发病日趋严重，严重影响其产量和品质。本实验以黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporium）和黄瓜种子为实验材料，通过组织分离和单孢分离得到了黄瓜枯萎病菌单孢菌株;通过Blast、Conserved Domain Search及DNAMAN对番茄枯萎病菌基因组数据库中PLCs进行了分析;根据番茄枯萎病菌PLC4基因设计引物，克隆得到FoPLC4基因;根据FoPLC4基因，构建了敲除载体和回复载体，获得FoPLC4基因敲除突变体和回复突变体;通过对FoPLC4基因敲除突变体和回复突变体表型和致病性分析，明确了FoPLC4基因在致病过程中的作用。所得结果如下:
1.组织分离获得病原物，将病原物进行回接实验，根据柯赫氏法则确定分离到的病原物即为黄瓜枯萎病菌。单孢分离获得45株单孢菌株，进行致病性测定，选出致病力较强的菌株。
2.通过Blast确定了番茄枯萎病菌有9个PLC基因，明确其在基因组染色体上的位置，并根据位置命名。Conserved Domain Search分析，都具有PLC的典型结构特征。PLC4和PLC6具有PLC的四个基本结构;PLC1和PLC9没有EF手形区，只有PH结构域、C2区和催化区;PLC2、PLC3、PLC7、PLC8只有催化区和C2区;PLC5没有PH区。DNAMAN序列比对各PLC基因，PLC6与PLC1、PLC9具有较高的同源性。
3.根据番茄枯萎病菌PLC4基因序列设计引物，克隆得到黄瓜枯萎病菌PLC4基因(FoPLC4)。对FoPLC4基因的结构进行了分析，FoPLC4基因DNA全长3282 bp，没有内含子，编码1093个氨基酸，从231到334个氨基酸为PH结构域，从419到504个氨基酸为EF结构域，从510到653个氨基酸为X结构域，从775到859个氨基酸为Y结构域，从893到1041个氨基酸为C2结构域。
4.根据番茄枯萎病菌基因组序列设计引物，利用基因同源重组技术，以潮霉素磷酸转移酶基因取代FoPLC4基因的部分编码区。以质粒pCB1003为基础构建了含有潮霉素B抗性标记的FoPLC4基因敲除载体。制备了黄瓜枯萎病菌原生质体，利用重组DNA载体片段进行PEG-原生质体转化，得到潮霉素B抗性转化子，通过潮霉素磷酸转移酶基因特异性引物及FoPLC4基因特异性引物对转化子进行PCR筛选，进一步进行RT-PCR验证，得到了黄瓜枯萎病菌的敲除突变体△FoPLC4。
5.利用质粒pCB1532构建了FoPLC4基因回复载体，以FoPLC4基因敲除突变体为初始菌株，进行原生质体转化，得到磺酰脲（Sulfonylurea, Sur）抗性转化子，通过FoPLC4基因特异性引物对转化子进行PCR和RT-PCR验证，得到回复突变体△FoPLC4/PLC4。
6.通过FoPLC4基因敲除突变体和回复突变体的表型和致病性分析，发现与野生型相比，FoPLC4基因敲除突变体的气生菌丝数量明显减少，在PDA培养基上产生稀疏、蓬松的气生菌丝，菌落颜色加深;产孢量较野生型和互补菌株显著减少，与野生型相比，减少了的82.2％，并且分生孢子形态较野生型变得长;接种后△FoPLC4突变体的病情指数明显降低，与野生型相比，降低了53.3％。回复突变体能够恢复其表型和致病力。结果表明FoPLC4基因参与了黄瓜枯萎病菌菌丝生长、分生孢子产生、分生孢子形态建成及致病过程。
黄瓜枯萎病菌;磷脂酶C;致病性;突变体表型
山东农业大学
硕士
植物病理学
梁元存
2013
中文
S436.421
87
2013-10-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）