耐热真菌纤维素酶基因的克隆与序列分析
高温真菌是一类在高温环境中能够表现出高生存能力的微生物类群，主要包括嗜热真菌(thermophilic fungi)与耐热真菌(thermotolerant fungi)。高温真菌在世界范围内分布广泛，目前，已报道的嗜热、耐热真菌超过130种。高温真菌与人类的生活密切相关，其产生的纤维素酶、淀粉酶、脂肪酸合成酶等有较高的热稳定性，在实际的生产和生活中有较高的应用前景和研究价值。近些年来，围绕着高温真菌开发利用的研究课题竞相开展，具有重要的战略意义。
纤维素酶(cellulase)是指能够将纤维素降解为葡萄糖的一组酶的总称。近年来越来越多的研究发现纤维素酶分子具有多样性，产纤维素酶微生物一般不会只有一类纤维素酶组分，即使只产生一类纤维素酶组分，也往往有多种不同的形式且不同纤维素酶的分子量相差较大。纤维素酶的分子多样性现象，使得人们通过分子生物学技术对探索葡聚糖酶类分子多样性及多样性的进化起源产生了浓厚的兴趣。本实验以耐热真菌为实验材料，对纤维素酶基因进行克隆，并对这些序列进行分析，主要结果如下:
从NCBI下载不同家族的纤维素酶序列，根据保守区设计不同家族的简并引物，从8种耐热真菌中克隆得到11个外切纤维素酶基因的全长DNA和cDNA序列，包括4个第六家族纤维素酶基因，分别命名为gh-1、gh-5、gh-7、gh-9以及7个第七家族纤维素酶基因，并依次命名为gh-2、gh-3、gh-4、gh-6、gh-8、gh-10、gh-11。并将获得基因的cDNA在GenBank中注册。
运用DNAMAN、SignalP4.1等软件对获得基因进行核苷酸序列和氨基酸序列分析。从核苷酸序列上看，11个基因的DNA和cDNA长度大小不等，其中最长基因为第7家族gh-8，DNA和cDNA分别为1662bp和1593bp;最短基因为第6家族gh-5，DNA和cDNA分别为1207bp和1140bp。不同基因的内含子个数也不相同。从氨基酸序列上看，相同家族的氨基酸有较高的同源性，不同家族的纤维素酶基因的分子量和等电点存在一定差异。11个基因都有1-6个不等的糖基化位点，并对这些基因的信号肽进行了预测，发现大多数基因N端存在长约17-18个氨基酸的信号肽序列，但gh-10和gh-11基因信号肽不明显。将获得的基因通过NCBI的Blast进行比对，发现第6家族纤维素酶基因中gh-1基因与已提交序列中Myceliophthora thermophila ATCC42464的1，4-beta-cellobiosidase相似度最高，相似度为86％。而基因gh-5、gh-7、gh-9与Myceliophthora thermophila ATCC42464的另外一种glycoside hydrolase family6 protein的相似度较高，分别为79％、79％和81％。第7家族纤维素酶基因中gh-4基因与已提交序列中Hypocrea rufa的1，4-beta-cellobiohydrolase的相似度最高，为94％。基因gh-2、gh-3、gh-6、gh-8同与Myceliophthora thermophila ATCC42464的1,4-beta-cellobiosidase相似度较高，分别为87％、77％、75％和79％。基因gh-10和gh-11都与Thielavia terrestrisNRRL8126的glycoside hydrolase family7 protein的相似度最高，分别为86％和87％。
应用Clustalx和MEGA4软件构建系统进化树，并进行了同源性分析。根据氨基酸序列同源树与系统发育树分析可知，基因序列相似性所建立的同源树，显示与传统的分类地位基本一致。同属于第六家族的纤维素酶基因gh-5、gh-7、gh-9是一个分支，同源性较高。第六家族的基因gh-1与Myceliophthora thermophila ATCC42464的同源性较高。第七家族纤维素酶基因gh-2、gh-3、gh-8是一支，与基因gh-6之间同源性较高;gh-10和gh-11是一支，与Thielavia terrestris NRRL8126的同源性高达90％;第七家族基因gh-4单独一支。
本文主要从8种耐热真菌中克隆得到11条外切纤维素酶基因，并对这些序列进行了分析，明确了纤维素酶基因的多样性现象。所得的11个基因全部来自耐热真菌，具有较高的热稳定性，这为纤维素酶今后的开发和高效利用奠定坚实的基础。
耐热真菌;纤维素酶;基因克隆;同源性
山东农业大学
硕士
植物病理学
李多川
2013
中文
Q785
108
2013-10-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）