轮枝镰孢(Fusarium verticillioide)五种疏水蛋白的功能研究
疏水蛋白是由丝状真菌特异产生的一类分泌型小分子蛋白质，分子量在10kDa左右，疏水蛋白最主要的特点是其肽链含有8个半胱氨酸，形成四个链内二硫键。疏水蛋白能够在疏水介质的表面自我折叠，改变介质表面的疏水或亲水特性，在真菌菌丝的生长发育，孢子的扩散传播以及病原真菌致病性上都有重要的功能。先期研究表明部分真菌疏水蛋白具有凝集素性质，而凝集素在分子识别中发挥着重要作用。本研究选取轮枝镰孢（Fusarium verticillioide）的五种疏水蛋白基因作为研究对象，研究它们表达产物的凝集活性以及与轮枝镰孢的寄生性真菌纤细齿梗孢（Olpitrichum tenellum）互作中的功能。
根据GenBank中注册的三种疏水蛋白基因序列设计引物，通过RT-PCR扩增得到轮枝镰孢的三种疏水蛋白基因FvHYD3、FvHYD4及FvHYD5，构建了三种基因及FvHYD3与嗜热子囊菌光孢变种（Thermoascus aurantiacus var.levisporus）纤维素酶基因eg1融合基因的重组酵母表达载体，分别命名为pPIC9K/HYD3、pPIC9K/HYD4、pPIC9K/HYD5和pPIC9K/HYD3-eg1，转化酵母菌株GS115后筛选获得酵母工程菌株G-HYD3、G-HYD4、G-HYD5、G-HYD3-eg1，将上述工程菌株和含有疏水蛋白基因FvHYD1和FvHYD2的酵母工程菌株G-HydⅠ和G-HydⅡ进行诱导表达，纯化后的产物分别命名为Hyrophobin3、Hyrophobin4、Hyrophobin5、融合蛋白RH及Hyrophobin1、Hyrophobin2，Western-blot验证表明我们获得的纯化产物为疏水蛋白。
五种疏水蛋白分别对兔血红细胞、轮枝镰孢（F.verticillioide）孢子、九州镰孢菌(Fusarium kyushuense）的孢子以及纤细齿梗孢(O.tenellum)的孢子进行凝集反应，结果表明五种蛋白都具有明显的凝集活性，但是每种蛋白对不同孢子的凝集活性不同，并且部分糖溶液和金属离子对疏水蛋白的凝集活性有影响。融合蛋白的研究表明RH能够吸附于酵母菌体和疏水介质聚氯乙烯表面，表明疏水蛋白具有极强的粘附特性，并且该性质与疏水蛋白的凝集活性密切相关。为了深入研究寄生性真菌纤细齿梗孢对轮枝镰孢的初始分子识别机制，本实验将轮枝镰孢（F.verticillioide）五种疏水蛋白基因进行敲除，采用PEG介导转化法，经过潮霉素抗性筛选，成功获得了FvHYD5基因缺失的突变体，但是两者互作研究没有表型差异。
选取Hyrophobin3、Hyrophobin4及Hyrophobin5的纯化产物与玉米叶片互作，透析液作为对照，研究表明Ⅱ型疏水蛋白Hyrophobin4和Hyrophobin5能够诱导玉米防御反应酶的表达，Hyrophobin4能够显著提高防御反应酶的活性，Hyrophobin5虽能引起防卫反应酶活性的提高，但是效果并不显著。此外，将Hyrophobin4注入玉米髓部组织，结果表明该蛋白能够显著提高玉米髓部组织防御反应相关酶的活性，特别是POD酶活性。
通过以上的研究工作，表明了轮枝镰孢（F.verticillioide）五种疏水蛋白具有凝集活性，轮枝镰孢Hyrophobin1、Hyrophobin2、Hyrophobin3及Hyrophobin4对其寄生性真菌纤细齿梗孢(O.tenellum)的孢子具有凝集作用，这说明疏水蛋白在两种真菌的分子识别上发挥着一定作用，这些研究为菌寄生真菌的初始分子识别机制的研究提供了新的思路。目前Ⅱ型疏水蛋白的致病机制并没有得到明确阐释，本实验研究表明Ⅱ型疏水蛋白Hyrophobin4能够显著提高玉米防卫反应相关酶的表达及活性，为Ⅱ型疏水蛋白的致病机理的阐明提供了新的依据和思路。
疏水蛋白;菌寄生真菌;凝集活性;分子识别;轮枝镰孢
山东农业大学
硕士
植物病理学
李多川
2013
中文
S432.44
120
2013-10-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）