坦布苏病毒的分离鉴定及荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用
坦布苏病毒感染是由坦布苏病毒(Tembusu virus，TMUV)引起的一种以蛋鸭产蛋量下降和雏鸭神经症状为主要特征的传染性疾病。主要表现为发生迅速、流行范围广、传播速度快、发病率和死亡率都较高，严重威胁我国养鸭业的发展，加强该病的研究对保护和促进我国养鸭业的发展具有重要意义。
TMUV感染于2010年由曹贞贞、张大丙首次报道，之后在我国的大部分养鸭地区流行。建立精确、快速的检测方法是控制TMUV的有效措施。本研究从发病雏鸭脑内分离到一株TMUV，并对该病毒的生物学特性进行了研究;建立了荧光定量PCR的检测方法，利用建立的方法对雏鸭和蛋鸡不同组织器官中的TMUV分布情况进行了检测，从而为TMUV致病机理的研究提供理论依据
一、坦布苏病毒SDLZ株的分离鉴定
通过鸭胚尿囊腔接种，从疑似TMUV感染的病料组织中分离得到一株病毒，通过RT-PCR方法和动物回归试验对分离株进行鉴定，并对该毒株的培养特性进行了研究。分离毒株RT-PCR鉴定结果显示，PCR产物与设计引物预期产物大小一致，克隆测序结果与GenBank中的TMUV相应片段的核苷酸同源性均为100％。分离毒株人工感染雏鸭后的症状及病理变化与自然感染的病例相同;鸭胚半数致死量DELD50为10-4.5/0.2mL;该毒株可在鸡胚、鸭胚、鸭胚成纤维细胞(DEF)、非洲(绿)猴细胞(Vero)中培养增殖，并引起胚体和细胞病变。上述结果表明，分离毒株为TMUV，命名为SDLZ株。
二、坦布苏病毒荧光定量PCR快速检测方法的建立与应用
根据本实验室测定的一株TMUV全基因序列（SDLZ株），选择该序列的E基因和NS5基因作为病毒蛋白基因，分别在其保守区域设计并合成特异性引物，扩增长度为225bp和264 bp的目的片段。以β-actin肌动蛋白基因为内参基因，扩增长度为139 bp的目的片段。将PCR扩增的的片段分别连接到pMD18-T载体上构建重组质粒，经筛选、鉴定纯化后，倍比稀释作为标准品，用于实时荧光定量PCR中NS5、E基因及内参基因β-actin标准曲线的构建，建立检测坦布苏病毒的相对荧光定量RT-PCR方法。研究结果表明，构建的荧光定量PCR检测方法检测10倍梯度稀释的β-actin、NS5和E质粒标准品，最小检出模板浓度约为10 Copies/μL，E基因、NS5基因和β-actin基因的Ct值与阳性质粒标准品的浓度均成良好的线性关系，标准曲线线性关系R2值均在0.99以上;特异性结果表明，E基因、NS5基因和β-actin基因的熔解曲线单一，表明扩增产物单一，无非特异性产物和引物二聚体;重复性结果显示，E基因、NS5基因和β-actin基因的批内、批间变异系数均小于0.5％。本研究建立的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法快速、稳定、特异性强、灵敏度高，可以用于TMUV早期检测，以便于早发现，以及时采取相应的防治措施，减少TMUV感染对养鸭业造成的危害。
三、坦布苏病毒在雏鸭体内的动态分布规律
将纯化的TMUV人工感染3日龄雏鸭，定期剖杀攻毒组和对照组雏鸭，用建立的荧光定量PCR方法对各组织病料进行检测。结果显示:试验组雏鸭人工感染3d后可在各个组织中检测到TMUV，感染后7d在各组织中的相对表达量达到最大，感染15 d天仍能在各组织中检测到病毒。TMUV相对表达量最高的器官为胰脏、脑、心脏，相对表达量在0.5～0.8之间，表明这些器官是TMUV感染后的主要靶器官。其次为肝脏、脾脏，相对表达量在0.4～0.6之间。表达量较低的为法氏囊和肺脏，相对表达量在0.2～0.4之间
四、坦布苏病毒在蛋鸡体内的分布规律
应用建立的荧光定量PCR方法检测TMUV感染产蛋鸡不同组织在不同时间段TMUV的相对表达量的变化，结果显示:攻毒后3d在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、胰脏、卵泡、输卵管中均可检测到坦布苏病毒，各组织TMUV的相对表达量都较高，其中卵泡和输卵管最高;攻毒后5d肝脏、脾脏、肺脏、胰脏的病毒含量减少，卵泡和输卵管含量没有变化;攻毒后9d，只在卵泡中检测到病毒。坦布苏病毒相对表达量最高的的器官为卵泡和输卵管，其次为心脏、肝脏、脾脏，肺脏和胰脏的相对表达量最低。结果表明，坦布苏病毒虽然没有对蛋鸡造成明显的临床症状和病理变化，但是在产蛋鸡体内各组织器官均检测到了坦布苏病毒的存在，说明坦布苏病毒能够感染蛋鸡且在产蛋鸡体内存活并增殖。
坦布苏病毒;分离鉴定;相对荧光定量PCR;鸭
山东农业大学
硕士
预防兽医学
居有祥
2013
中文
S855.3;S858.32
79
2013-10-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）