基于“caveolin-p38MAPK”通路研究壮骨健膝方对体外诱导退变关节软骨细胞的影响
目的:
基于“caveolin-p38MAPK”信号通路几个关键信号分子及其下游促分解性细胞因子、MMPs与软骨细胞凋亡等效应指标的变化，从分子生物学水平明确壮骨健膝方对IL-1β诱导退变关节软骨细胞的的影响及其作用机制，为该方应用于临床奠定实验基础。
方法:
1.20只普通级3月龄新西兰兔，随机分为空白血清组（0.9％生理盐水灌胃）与含药血清组（壮骨健膝方药液灌胃），连续灌胃5天，2次/日，于末次灌胃3h后腹主动脉采血，制备新西兰兔的正常血清及壮骨健膝方含药血清。
2.取4周龄普通级新西兰兔双侧膝关节透明软骨,建立离体培养的关节软骨细胞体系，应用形态学观察、甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原染色观察并鉴定，MTT法检测第2代软骨细胞增殖情况。
3.10ng/ml IL-1β诱导软骨细胞退变，甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原染色观察并鉴定;MTT法检测壮骨健膝方含药血清对退变软骨细胞增殖的影响，并确定含药血清干预的最佳时间及浓度。
4.诱导退变的软骨细胞随机分为模型组、含药血清组、阻滞剂组（SB203580干预）、含药血清+阻滞剂组，并设无IL-1β诱导干预的为正常组，分别干预48h后，流式细胞术检测细胞的凋亡率;Western Blot法检测软骨细胞中caveolin-1和p-p38蛋白的表达;RT-PCR检测细胞IL-1β、TNF-α、MMP-3、MMP-13及caveolin-1mRNA表达的变化。
结果:
1.研究中分离培养的第2代关节软骨细胞，经形态学观察、甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原染色显示符合软骨细胞的生物学特性。IL-1β干预的关节软骨细胞呈现退变表现:细胞生长速度减慢，细胞变狭长，胞内见空泡，形态不规则，其甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色均变淡。
2.壮骨健膝方含药血清对IL-1β诱导退变的软骨细胞增殖作用呈剂量依赖性的促进趋势，48h时，正常组、15％、20％含药血清组与模型组比较有显著性差异(p＜0.05)，而10％含药血清与模型组无明显差异(p＞0.05)，含药血清以20％为最佳干预浓度，其最佳干预时间为48h。
3.IL-1β诱导退变的软骨细胞再继续培养48h出现明显的凋亡，凋亡率达（14.17±0.43）％，含药血清组、阻滞剂组、含药血清+阻滞剂组细胞凋亡率明显降低，与模型组比较均有极显著差异(p＜0.01);含药血清+阻滞剂组与单纯阻滞剂组比较，凋亡率也显著下降(p＜0.05)。
4.IL-1β诱导退变的软骨细胞中caveolin-1、p-p38蛋白的表达均见增强。其中模型组的caveolin-1、p-p38的表达显著增加，含药血清及SB203580均可降低其表达。各组软骨细胞IL-1β、TNF-α、 MMP-3、MMP-13、caveolin-1 mRNA均见表达，模型组明显增强(p＜0.01)，含药血清及SB203580均能一定程度降低其表达，当含药血清与SB203580联合使用时，其mRNA表达进一步降低。
结论:
IL-1β诱导的兔软骨细胞退变过程存在“caveolin-p38MAPK”信号通路的激活，表现为caveolin-1与p-p38的蛋白表达增高，通路下游软骨细胞出现过凋亡及IL-1β、TNF-α、MMP-3、MMP-13、caveolin-1 mRNA的表达升高。壮骨健膝方保护关节软骨细胞的作用机制可能与促进诱导退变关节软骨细胞的增殖，抑制“caveolin-p38MAPK”信号通路中关键蛋白caveolin-1与p-p38的蛋白表达，降低通路下游IL-1β、TNF-α、MMP-3、MMP-13、caveolin-1 mRNA的表达并减少退变关节软骨细胞的凋亡密切相关。
骨关节炎;壮骨健膝方;软骨细胞
福建中医药大学
硕士
中医骨伤科学
苏友新
2013
中文
R274.9;R285.5
50
2013-10-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）