槲皮素和原花青素对4-硝基酚诱导的小鼠生殖细胞损伤的缓解作用
随着交通工具的不断普及，因汽车的过度使用而产生的环境污染问题越来越受到人们的关注。汽车尾气中存在着大量的有机颗粒，而这些有机颗粒对人和动物可以产生很严重的生殖损伤作用。本研究首先探讨了4-硝基酚引发的雄性小鼠生殖损伤情况。黄酮类化合物是自然界普遍存在的一种天然化合物，具有良好的抗氧化能力。然而黄酮类化合物是否对4-硝基酚引发的生殖损伤具有缓解作用还未知。本研究选取了槲皮素和葡萄籽提取物两种黄酮类化合物为代表，探讨了这两种化合物对4-硝基酚造成的生殖毒性缓解作用及其机理。1.4-硝基酚诱导雄性小鼠睾丸损伤模型的建立
48只ICR成年雄性小鼠随机分成四组，每组12只。4-硝基酚(4-nitrophenol,PNP)采用四个剂量组，分别为0、2、10和50 mg/kg。采用腹腔注射，每周一次，处理时间为6周。在第1周、2周、4周和6周，每组脱臼处死6只小鼠，取出睾丸，4％多聚甲醛固定后做石蜡切片，HE染色观察小鼠睾丸组织形态学的变化。实验结果表明，50 mg/kg的PNP处理6周小鼠睾丸出现比较明显的损伤现象，表现为生精上皮变薄，曲细精管中有散落的生精细胞等现象。因此，这个剂量和处理时间被用于后续的实验研究。
2.槲皮素对4-硝基酚诱导的雄性小鼠生殖细胞凋亡的缓解作用的研究
本实验利用已经建立的小鼠睾丸损伤模型，研究了槲皮素对4-硝基酚(PNP)诱导小鼠生殖细胞氧化损伤的缓解作用及其机理。实验结果发现，50mg/kg的PNP可以引起小鼠睾丸的局部严重损伤，其表现为睾丸曲精细管的损伤，生精上皮变薄，生殖细胞数量显著减少。PNP显著增加了睾丸组织的羟自由基、活性氧的生成，导致脂质过氧化发生，引起丙二醛(MDA)含量增加，破坏了细胞自身的抗氧化体系（SOD及GSH-Px的下降），进而改变线粒体中抗凋亡蛋白Bcl-x(l)和Bax的表达水平及内质网应激相关基因XBP-1和HO-1的mRNA水平，激活Caspase-3活性，最终导致了生殖细胞的凋亡。而联合黄酮类物质槲皮素后，可以有效缓解PNP造成的睾丸毒性作用。联合处理后小鼠睾丸生精上皮相对完整，睾丸组织中羟自由基、过氧化氢水平等抗氧化指标接近正常水平。Bcl-x(l)表达升高，Bax下降，XBP-1和HO-1的mRNA水平恢复正常，caspase-3活性也明显受到了抑制，生殖细胞TUNEL阳性数量也显著降低。这些结果表明，氧化应激是PNP引起睾丸损伤的重要原因之一。而黄酮类物质槲皮素具有抗氧化及抗凋亡作用，可以明显缓解PNP的毒性作用。因此，上述成果为进一步研究PNP引发的氧化损伤对生殖机能的损害作用及其修复机理奠定了理论基础。
3.葡萄籽提取物对4-硝基酚抑制生精化过程的缓解作用
本实验利用已经建立的小鼠睾丸损伤模型，探究了PNP对成年雄性小鼠的生殖功能的损伤，以及添加原花青素对PNP诱导的生殖功能损伤的缓解作用机理。实验结果发现，PNP会影响精液品质，导致精液质量下降，其表现为精子总数下降，畸形精子的比例增加;PNP显著增加了睾丸组织的羟自由基生成，导致脂质过氧化发生，引起MDA含量增加，破坏了细胞自身的抗氧化体系（SOD及GSH-Px下降），同时睾丸的生精上皮生殖细胞脱落，生精上皮变薄;此外，附睾滋养层也变薄。BrdU免疫荧光染色发现睾丸中增殖的细胞数量显著下降。添加葡萄籽提取物原花青素后，小鼠的精液品质得以恢复，精子数量增加了，畸形精子的比例也明显下降了。睾丸和附睾的形态结构也恢复到了正常形态结构，睾丸中各级生精细胞排列整齐，附睾中滋养层变厚。睾丸组织的抗氧化水平有相应的提高。睾丸中正在增殖的生精细胞液增加了。因此，上述成果为进一步研究硝基酚衍生物引起的干扰效应，对生殖机能的损害作用及其修复机理奠定了理论基础和参考依据。
小结:以上结果表明，PNP造成了雄性小鼠严重的生殖损伤作用，不仅使睾丸的曲细精管的形态结构发生严重的损伤，还能使小鼠附睾的滋养层变薄。此外，小鼠精子总数也下降，小鼠畸形精子比例也增加。小鼠睾丸中增殖的生精细胞数量减少。还通过引起氧化应激和内质网应激，引起抗氧化状态的改变，改变凋亡相关蛋白Bax和Bcl-x(l)和XBP-1 and HO-1 mRNAs基因的表达，激活caspase-3，最终引起生精细胞凋亡。作为广泛存在的强抗氧化剂，槲皮素和原花青素被证实具有能够缓解因为PNP引起的生殖损伤作用，通过下降脂质过氧化，恢复抗氧化状态，调节相关蛋白和基因的表达从而起到缓解作用。
4-硝基酚;槲皮素;原花青素;氧化损伤;细胞损伤
浙江大学
硕士
基础兽医学
米玉玲;张才乔;裘志明
2013
中文
S853.7
77
2013-10-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）