在水稻体细胞根芽发育过程中呈差异表达的Osj10gBTF3,OsCROC-1和OsUbc13功能研究
Osj10gBTF3，OsCROC-1和OsUbc3是本实验室前期在研究水稻体细胞根芽发育相关蛋白组的表达规律时，以只长根、只长芽和根芽全长三组再生组织为基本材料，经定时定点取样和蛋白质双向电泳分析及蛋白质测序，从近百份呈差异表达的蛋白质点中选取出来的3个与根芽发育相关的基因(张晓波博士学位论文，2010)。
本研究以这些基因为研究对象，通过反向遗传学等手段对它们在水稻中的功能进行了分析及验证。并运用现代生物学手段着重对Osj10gBTF3和OsUbc13进行了蛋白质序列聚类、表达模式、亚细胞定位和蛋白质相互作用分析。所取得的主要结果和结论如下:
(1) Osj10gBTF3是新生多肽相关复合体(Nascent polypeptide-associatedcomplex，NAC)的β亚基，含有一个NAC保守功能域，一个线粒体基质锚定信号(mitochondrial matrix targeting sequence，MMTS)，一个核定位信号(nuclearlocalization signal，NLS)及一个内质网滞留信号(ER-retention/retrieval signal，ERRS)。聚类分析表明不同来源的BTF3蛋白共分成三类:动物、植物、酵母。该基因组成型表达于水稻的各个组织如根、茎、叶、雌雄蕊、内外稃中，以根中的表达量为最多。Osj10gBTF3能够响应高温、盐、激素等外界环境的胁迫。Osj10gBTF3与增强型绿色荧光蛋白融合表达于细胞质及细胞核中，说明水稻Osj10gBTF3蛋白同时在细胞质和细胞核中发挥作用。在水稻中过量表达Osj10gBTF3不会产生明显的表型效应，但由RNA干扰介导的Osj10gBTF3基因沉默则导致水稻植株显著微型化和花粉典型败育;这些结果证实Osj10gBTF3在水稻的生长发育过程中发挥重要作用。
(2) Osj10gBTF3经RNA干扰后导致的水稻植株微型化表现在根变细缩短、根数量减少、茎各节间缩短变细、叶长缩短、叶片变窄以及主穗轴长缩短、一次枝梗减少、穗粒数减少等，各组织或器官缩小或减少的幅度在25-52％之间;对Osj10gBTF3干扰植株根、茎、叶的显微切片观察发现，根皮层横断面细胞层数明显减少并且细胞变小，维管束及其导管也变小;茎薄壁组织中的细胞减少变小，维管束及其导管、通气组织变小;叶片侧脉数减少了近一半，中脉的维管束、导管、通气组织变小，通气组织间的薄壁细胞变少，叶肉也明显变薄。根和茎的纵切面细胞大小的变化更为明显直观。切片中各组织、细胞面积减小或数目减少的幅度在24-68％之间。这些结果表明由Osj10gBTF3基因沉默引起的水稻植株微型化是各组织或器官在细胞水平上的变化造成的。
(3)进一步的蛋白质互作分析发现Osj10gBTF3经RNA干扰引起的花粉典型败育和与之存在相互作用的PPR蛋白OsPPR676和OsPPR920、热激蛋白OsHsp82、翻译起始因子OseIF3e.OseIF3h有关，随后的半定量和实时定量PCR对这些基因的转录本检测结果验证了这一点。在Osj10gBTF3干扰植株中，OsPPR676, OsPPR920，OsHsp8和OseIF3h的表达量出现不同程度的下调，而OseIF3e的表达量却出现了显著的上调。而且，OsHsp82、OsPPR920、OsPPR676、OseIF3e、OseIF3h和Osj10gBTF均在雌蕊中表达。
(4)OsCROC-1和OsUbc13:前者编码一种泛素缀合酶样蛋白(Ubc-likeprotein),又叫泛素缀合酶变体(ubiquitin-conjugating E2 enzyme variant)。对该基因进行过量表达和RNAi抑制均不会对水稻生长发育产生明显影响，即使是在用诱变剂MMS处理的情况下，纯合的OsCROC-1过量表达及干扰植株的种子发芽率及存活率都会维持在正常水平，与对照之间并无明显区别。而与之存在相互作用的泛素缀合酶蛋白OsUbc13经RNA干扰沉默后则会导致水稻叶片发黄、不结实、容易死亡。OsUbc13与OsCROC-1之间的相互作用已被酵母双杂交分析结果所证实。另外，本研究结果还证实OsUbc13与Osj10gBTF3—样组成型表达于水稻的各个组织，且能主动响应外界胁迫。
综上所述，本研究从分子水平上初步阐明了Osj10gBTF3和OsUbc13的生物学功能，这两个基因在水稻生长发育过程中是不可缺少的，一旦它们的表达受到抑制，水稻就会表现出各种生长发育缺陷。同时，我们还发现OsCROC-1对水稻生长发育不产生明显影响。
水稻;根芽发育;亚细胞定位;Osj10gBTF3基因;OsCROC--1基因;OsUbc13基因;蛋白质序列
浙江大学
博士
作物学
凃巨民
2012
中文
S511.01
150
2013-10-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）