番茄生长素反应基因的分离与表达分析及SlARF5基因功能的初步研究
作为第一个被发现的植物激素，生长素在植物生长发育的各个阶段都发挥着巨大的作用。ARF(Anxin Response Factor)作为一种转录因子，在生长素信号传导中起着关键的作用。ARF编码的蛋白可以通过与生长素反应基因启动子区域的生长素反应原件结合来调节这些基因的表达。AUX/IAA基因家族的基因编码的蛋白质在生长素信号传导的过程中通过与ARF基因结合抑制其作用来调控基因表达。IAA，GH3和SAUR基因的mRNA水平可以迅速被生长素所诱导，因此被称为生长素原初反应基因。在不时栽培中，在开花结果期如遇逆温（低温或高温）就会发生授粉受精不良，落花落果等现象，直接导致坐果率下降，畸形果数量增加，严重影响到番茄的产量和品质。而前人的研究表明，生长素相关基因特别是ARF和AUX/IAA基因在番茄果实的单性结实中发挥着重要的作用。因此，对番茄生长索相关基因的全基因组分析必将为以后研究每个基因的功能以及进一步应用到生产实践提供依据。
本研究主要以番茄Micro-Tom品种作为研究对象，主要研究生长素相关的基因在番茄幼果发育过程中的时空表达特性，构建SIARF5的Artificial MirRNA植物表达载体并进行转基因工作，获得了番茄转基因植株并初步分析S1ARF5在番茄坐果以及果实发育过程中的作用。本研究旨在探讨生长素调控植物果实坐果和果实发育的分子机制，为在生产上解决番茄坐果不良等问题寻求重要理论依据。
主要研究结果如下:
(1)通过搜集其它物种中已经公布的ARF基因的氨基酸序列在番茄基因组数据库中进行TBLASN的同源比对。将比对后得到的DNA序列预测去除内含子后再通过一系列的包括电子克隆和分子克隆的方法共分离出21个番茄ARF基因。这些基因的碱基序列长度从1218bp(S1ARF12)到3372bp(S1ARF7)不等。21个基因分布在除了9号以外的所有的11条染色体上。大部分的番茄ARF基因包含了DBD、MR和CTD三个功能域。但是S1ARF3,6-1，12-14,13-1和17这7个基因缺失了第三个功能域。进化分析表明21个基因可以分为Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ三组。其中组Ⅰ和组Ⅱ可以进一步细分。表达分析表明S1ARF基因在植株的各个部位表达差异不大，为组成型表达。在花蕊的发育过程中表现出多样化的表达模式。在子房的发育过程中，但部分的基因呈现出先升高后下降的表达模式，但是S1ARF4则是持续升高。
(2)通过与(1)中相同的方法，从番茄基因组中一共鉴定出了26个AUX/IAA基因。这些基因的碱基长度从228bp(S1IAA13)到1050bp(S1IAA4)不等。26个基因分布在除了2号，10号和11号之外的所有的9条染色体上。大部分的番茄IAA基因包含了所有的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ四个功能域，但是S1IAA13、15、16、18、20和27则缺失了第Ⅰ和Ⅱ两个功能域。进化分析表明，所有的26个S1IAA因可以细分为A和B两组，这两组还可以分别细分成5和3个小组。S1I从基因在植株不同部位的表达差异较大，表达模式比较特异。在花蕊的发育过程中除了个别的基因(S1IAA16、20、23和24)都表现出持续上升的模式。而在果实的发育过程中则表现出了多样化的表达模式。在激素处理之后，大部分的S1IAA基因都可以被生长素诱导上调表达，但是S1IAA19和20的表达却被IAA抑制。在逆境条件下，大部分的S1IAA的表达情况都有变化，但是变化的程度各不相同。
(3)用类似的方法从番茄数据库中鉴定出了32个番茄GH3基因。在这32个基因中有一半左右的成员是长度较小的基因。这是在以前的研究中没有报道过的。这32个基因分布在除了3号、4号、9号和11号之外的所有的8条染色体上，其中有5个(S1GH3.28-32)在已经拼接的基因组数据库中未找到确切的位置。按照前人的报道，这些基因按照进化关系可以分成Ⅰ和Ⅱ两组。对12条S1GH3进行表达分析表明，GH3在植株的不同部位的表达也是比较特异的。花蕊的发育过程中，不同基因的表达模式差异较大。而在子房的发育过程中均呈现出先增长后下降的表达模式。大部分的S1GH3基因对生长素的处理不敏感，只有GH3.18的表达在处理前后表现出了明显的差异。
(4)用类似的方法从番茄数据库中鉴定出了99个番茄SAUR基因。这些基因碱基的长度在186bp(S1SAUR30)到597bp(S1SAUR54)之间。大部分的基因都簇状分布在所有的12条染色体上。将所有已经公布的SAUR基因以及本研究中新鉴定出来的SAUR基因进行进化分析，所有的484个SAUR基因可以分为A、B、C和D四个大组，以及进一步细分成16个小组。S1SAUR基因在植株的不同部位表达差异明显。在子房和花蕊的发育过程中，不同基因的表达模式差异较大。从已经公布的所有的SAUR基因的氨基酸序列中，我们找到了26个基因含有组氨酸富集的区域。特别需要指出的是，S1SAUR58作为一个番茄中组氨酸含量最高的SAUR基因，它的表达可以被干旱胁迫和高温胁迫抑制，但是却被盐胁迫所诱导。S1SAUR也可以明显的被生长素诱导表达。这些证据表明S1SAUR58在连接生长素信号和盐胁迫信号中可能发挥着特殊的作用。
(5)构建了S1ARF5的人工MirRNA植物表达载体。首先以拟南芥中的miR164a作为骨架，用S1ARF5的特异片段替换掉miR164a上的成熟MirRNA序列。MiR164a至今没有报道会与ARF互作，排出了番茄中miR164a会与S1ARF5互作的可能。然后将合成的Artificial MirRNA连接入双元载体pCAMBIA1301-35s，命名为P35s:1031ArtmirRNA ARF5。以pCAMBIM301-35s作为空载对照。通过“冻融法”将P35s:1031 ArtmirRNA ARF5和pCAMBIA1301-35s导入农杆菌。最后根据已建立的高效番茄遗传转化体系，利用农杆菌介导的方法将S1ARF5Artificial MirRNA表达载体导入番茄中。经PCR检测验证，目前已成功获得了80个潮酶素抗性株系，转空载对照株系28个芽系。目前转基因工作仍在继续，得到的抗性株系正在观察。
番茄;生长素反应基因;基因表达;遗传转化;SlARF5基因
浙江大学
硕士
园艺学
卢钢
2012
中文
S641.2
122
2013-10-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）