甘蓝型油菜早熟基因遗传转化体系的建立及转基因植株初步鉴定
早熟是油菜育种改良的目标性状之一。近年来，随着现代生物技术的飞速发展与成熟，农杆菌介导的转基因技术广泛地运用在油菜上，但转化效率受到众多因素的影响，因此建立和完善一套稳定高效的再生和遗传转化体系非常重要。本文以甘蓝型油菜品种‘浙双758’等为研究材料，探讨了油菜再生和遗传转化体系中的相关问题，并对转基因苗进行了初步的PCR鉴定，取得的主要研究结果如下:
1.以子叶柄为外植体油菜再生体系的改进与完善。在本试验室研究基础上，进一步研究了切下子叶柄外植体时油菜的苗龄，常用外源激素的浓度及配比组合对子叶柄外植体再生频率的影响。试验结果表明，甘蓝型油菜不同品种的芽再生率和苗龄的关系走势大致相同，均随着时间的增加，苗龄越老，芽分化频率也随着快速下降，但下降的趋势和时间不完全相同。‘浙大619’最佳苗龄为播种后的第6天，此时再生率最高为65％，‘浙双758’和‘浙双72’最佳苗龄均为播种后第5天，芽的再生率分别为68％和65％。研究中还发现苗龄为10天时，三个品种的子叶外植体都基本不能再分化出再生芽，故用于再生的外植体不宜太老，应掌握好最佳的时间。在诱导愈伤的培养基上，2，4-D在低浓度范围下，诱导愈伤组织的能力随着2，4-D浓度的增加而增加，诱导的愈伤组织膨大呈绿色，致密;当2，4-D浓度超过一定范围后，愈伤组织的诱导率反而下降，并且诱导出的愈伤组织有的呈白色，在后续的再分化中不能正常分化出健康的再生芽;而本试验中采用低浓度的2，4-D和6-BA组合的预培养基，愈伤组织的分化情况好，分化的愈伤正常，愈伤的诱导率比2 mg/L2，4-D的预培养基要高，根据实验结果，最佳预培养基为MS+1 mg/L2，4-D+1 mg/L6-BA。在再生植株生根上，添加一定浓度的NAA对再生植株根的再生有显著的促进作用。当NAA超过一定浓度后，促进作用下降，但未达到抑制水平，试验结果显示最佳的生根培养基为1/2 MS+0.1mg/L NAA。Kan对再生植株的生根有一定的影响，会影响正常的生根，试验中应选择低浓度、且影响相对较小的Kan来筛选转化的植株。
2、农杆菌介导的甘蓝型油菜子叶柄外植体遗传转化体系的建立。试验结果表明:同一种抗生素同一浓度对带有目的基因的农杆菌LBA4404和EHA105的抑制效果不同，并且抑制效果随着抗生素浓度的升高而增大;不同的抗生素对带有目的基因的农杆菌的抑制效果也不同。用农杆菌EHA105转导目的基因到油菜，发现用抗生素抑菌较困难，易发生农杆菌污染，而LBA4404则可用抗生素很好地抑制住。转化体系中选用农杆菌LBA4404介导，抗生素用500 mg/L的特美汀。对于农杆菌侵染的时间和浓度的研究表明，油菜子叶柄外植体的褐化程度和污染率随着农杆菌侵染的菌液浓度和时间的增大而升高，高浓度或者长时间的菌液侵染子叶柄外植体，可能造成外植体全部褐化，并且在分化培养阶段500 mg/L的特美汀控制不住农杆菌的生长，导致外植体全部污染褐化死亡。选择农杆菌LBA4404菌液浓度为OD600=0.2时，褐化程度轻，抗性芽率也较高，农杆菌也容易控制，不会发生爆长的情况，在农杆菌LBA4404的OD600值为0.2时试验中选择60 s的侵染时间较好。在Kan的敏感性试验中，发现Kan对油菜子叶柄的再生有抑制作用，愈伤组织的诱导率随着Kan浓度的增大先下降后又上升，说明高浓度的Kan能促进子叶柄外植体愈伤组织的形成，但此时的愈伤是不正常的愈伤，愈伤组织色白坚硬，愈伤膨大到一定程度后生长势变弱，之后基本不能再进行正常绿色芽的分化，只能分化出一些白化、半白化和紫色的再生苗。综合各种因素，试验中宜选择含有15 mg/L Kan的培养基进行转化和筛选。
3、获得了农杆菌介导经过PCR初步鉴定为阳性的转基因植株。‘浙双758’子叶柄外植体愈伤组织经农杆菌侵染后进行抗性筛选及PCR验证获得的转基因植株。
甘蓝型油菜;农杆菌介导;再生体系;遗传转化;转基因植株
浙江大学
硕士
作物学
周伟军;毛碧增
2013
中文
S643.3;Q943.2
77
2013-10-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）