白菜花粉发育和授粉受精相关基因的表达分析与功能验证
花粉发育和授粉受精是植物生命周期中的重要环节，直接关系到蔬菜等农作物的产量高低、质量好坏、种子多少和品质优劣等。花粉发育和授粉受精过程的机制极其复杂，涉及众多基因的表达与调控。目前对这两个过程的已有研究成果尚不足以全面深入认识该过程。同时从转录组水平、转录后调控及基因表达与功能验证等三个方面对花粉发育和授粉受精进行分析，将为认识这两个相互独立又紧密联系的过程的分子调控机制提供入口和契机，具有十分重要的理论意义和应用价值。
本文以白菜（Brassica campestris L.ssp.chinensis Makino，syn.B.rapa ssp.chinensis）‘矮脚黄’核不育（‘Aijiaohuang’genic male sterility, ajhGMS）两用系‘Bcajh97-01A/B'、‘Polima’核质互作不育(polimagenic-cytoplasmic male sterility, polG-CMS)系‘Bcpol97-05A’以及‘Ogura’细胞质不育(ogura cytoplasmicmale sterility, oguCMS)系‘Bcogu97-06A’为材料，在通过授粉实验确定白菜‘矮脚黄’授粉受精过程的不同阶段及其所经历的时间的基础上，采用拟南芥全基因组表达谱芯片(GeneChip(R) ArabidopsisATH1 genome array，ATH1)分析‘Bcajh97-01A’授粉前后雌蕊的转录组差异;继而对Bcajh97-01A’授粉前后的雌蕊，以及3个不育系及其共享保持系的花序进行microRNA(miRNA)的表达差异分析，筛选白菜中与花粉发育及授粉受精相关的miRNA;随后，对两个类果胶酸裂解酶基因Brassicacampestris pectate lyase like9(BcPLL9)、BcPLL10及一个新基因Brassica campestris male fertile21（Bc MF21）进行结构、表达、进化等分析，并采用反义RNA技术对其分别受抑制后的转基因芽系进行形态学、分子生物学、细胞学等鉴定，分析其在白菜花粉发育和授粉受精中的作用机制。取得的主要结果与结论如下:
(1)植株形态和细胞学观察结果表明白菜授粉受精过程可划分为4个特征时期。以ajhGMS不育株系‘Bcajh97-01A’为母本，可育株系‘Bcajh97-01B'为父本，观察授粉后，花粉在柱头萌发和在花柱中的生长情况。其授粉受精过程表现出4个特征时期，其中时期Ⅰ(0～2 HAP)为花粉粘附、吸水和萌发，即花粉萌发期;时期Ⅱ(2～4 HAP)为花粉管在花柱中生长;时期Ⅲ(4～16 HAP)为花粉管在子房中生长，发生受精，即花粉管生长和受精期;时期Ⅳ(16～24 HAP)为胚胎发育早期。
(2)通过ATH1芯片分析，比较白菜授粉前后雌蕊转录组的差异，发现了77个授粉前后差异表达基因;将其与花粉发育相关基因进行比较，发现了10个花粉发育和授粉受精持续表达白菜同源基因。通过拟南芥ATH1芯片分析白菜‘Bcajh97-01A’授粉前后雌蕊转录组差异，在授粉后雌蕊中检测到44个上调表达和33个下调表达的基因，对它们进行功能分类发现上调表达基因中有20％与细胞壁代谢相关。通过授粉受精相关基因与前人报导的花粉发育相关基因进行比较，发现At2g02720等10个基因在花粉发育和授粉受精过程均表达上调，表现出持续表达。并且这10个基因中有7个与细胞壁发育相关，其中包含两个PLL基因(At2g02720，PLL9和At3g01270，PLL10)。
(3)白菜3个雄性不育系与其共同保持系花序的miRNA表达差异分析，表明不同遗传模式不育系花序miRNA表达具有相似性。利用植物microRNAμParafloTM微流体芯片（miRNA芯片）对白菜ajhGMS‘Bcajh97-01A’、polG-CMS' Bcpol97-05A’和oguCMS' Bcogu97-06A’及它们共同的保持系‘ Bcajh97-01B’的花序进行miRNA表达的比较分析，在‘Bcajh97-01A’与‘Bcajh97-01B'花序中检测到属于7个miRNA家族的差异表达的miRNA为11个;在‘Bcpol97-05A’与‘Bcajh97-01B'花序中检测到属于23个miRNA家族的差异表达的miRNA为64个;在‘Bcogu97-06A’与‘Bcajh97-01B'花序中检测到属于20个miRNA家族的差异表达的miRNA为70个。其中，在3个不育系中共同下调表达的miRNA基因家族有1个(miR894)、上调表达的有2个（miR172和miR399）。‘Bcajh97-01A’和‘Bcpol97-05A’共同下调和上调表达miRNA家族分别为1个和4个;‘Bcajh97-01A’和‘Bcogu97-06A’共同下调和上调的miRNA分别为1个和2个;‘Bcpol97-05A’和‘Bcogu97-06A’共同下调和共同上调表达的miRNA分别为8个和7个。这些结果表明不同遗传模式不育系花序miRNA表达具有相似性。采用miRNA芯片对白菜‘Bcajh97-01A’授粉前后的雌蕊进行分析，发现属于4个miRNA家族的6个miRNA下调表达，属于4个miRNA家族的16个miRNA上调表达。将授粉受精相关miRNA与花粉发育相关miRNA进行比较，发现有6个miRNA家族（miR896、miR1450、miR172、miRNA168、miR396和miR158）在两个过程均差异表达。通过对所有检测获得的差异表达miRNA进行比较，发现参与花粉发育或授粉受精的非冗余miRNA共30个。通过查找已发表的数据发现，在它们中，有近70％曾被报导在花粉中表达。
(4)通过基因表达和功能分析，发现花粉和雌蕊特异表达的类果胶酸裂解酶基因BcPLL9与花粉壁内壁相关。采用同源克隆的方法获得白菜类果胶酸裂解酶基因BcPLL9的cDNA和DNA全长，核酸结构和氨基酸结构分析表明其具有果胶酸裂解酶基因的特征。qRT-PCR和组织原位杂交分析表明BcPLL9的转录本在成熟花粉粒、雌蕊的柱头、花柱上部中表达。采用反义RNA技术抑制BcPLL9的表达后，发现转基因植株的花粉活力部分下降，当花粉体外萌发时，花粉管生长无力，管壁处于松散的状态，不像对照那样紧贴花粉管质膜;花粉管生长长度变短。形态异常的花粉管比例为44.8％。花粉管体内萌发时能穿过柱头组织，但是到达胚珠的花粉管比例降低，结籽数减少。BcPLL9反义RNA转基因植株的成熟花粉粒出现异常的胼胝质沉积，萌发沟部位异常突起，花粉内壁缺少清晰的内壁内层和内壁外层结构。
(5)通过基因表达和功能分析，发现花粉和雌蕊特异表达的类果胶酸裂解酶基因BcPLL10与花粉壁发育相关。采用同源克隆的方法获得白菜类果胶酸裂解酶基因BcPLL10的cDNA和DNA全长，核酸结构和氨基酸结构分析表明其同样具有果胶酸裂解酶基因的特征。qRT-PCR和组织原位杂交分析发现BcPLL10在成熟花粉粒、雌蕊的柱头、花柱和胚珠中表达;采用反义RNA技术抑制BcPLL10基因的表达后，发现转基因植株的花粉大小、形态不一，萌发沟位置异常，含油层外溢并包裹整颗花粉粒，有时导致花粉粘连。萌发沟处内壁外层过度增厚，内壁内层交薄;非萌发沟处内壁的内层和外层结构不明显。
(6)通过PLL基因家族的结构和进化模式分析，发现白菜PLL基因在其3个亚基因组上有不同的分布密度，表达模式趋向保守;PLL8、PLL9、 PLL10、PLL11可能是来自基因新功能化或亚功能化。通过对白菜46个PLL基因在其3个亚基因组的分布情况分析发现有18个位于高密度模块（lessfractionized, LF）上，分别有16个和12个位于两个低密度模块（more fractionized，MF1和MF2）上。这一结果支持芸薹属进化过程中经历两次四倍化跟随两次基因丢失过程的假说。对植物PLL基因的结构进行分析，发现PLL8、PLL9、PLL10、PLL11具有不同于其它PLL的N端保守结构域。对白菜PLL基因的表达分析发现BcPLL8、BcPLL9、BcPLL10、BcPLL11在花药和雌蕊中特异表达，推测它们是由其祖先基因新功能化或亚功能化产生。
(7)通过基因表达和功能分析，发现小孢子和绒毡层特异表达的BcMF21在花粉发育早期发挥作用。采用同源克隆和RACE-PCR技术对本实验室前期经cDNA-AFLP分析获得的差异表达片段（A18T19-4，BBP10/BPO054）克隆获得基因全长，通过核酸结构和氨基酸结构分析，发现其与已知基因同源性很低，可能是一个在花粉发育早期相关的新基因，逐按照本实验室命名与雄性育性相关的基因系统，命名为Brassica campestris male fertile21(BcMF21);生物信息学分析表明其可能在信号转导中发挥重要作用;RT-PCR和原位杂交分析表明其在减数分裂、四分体和单核小孢子时期的绒毡层和小孢子中特异表达。BcMF21反义RNA转基因植株的花粉有48.2％表现出个体小、干瘪、内陷;而个体大小正常，饱满的花粉的萌发沟附近的外壁被一层类似油脂类的物质覆盖，不具有清晰的网纹结构。这些结果表明BcMF21可能通过信号转导途径而在花粉发育早期发挥作用。
白菜;授粉受精;花粉发育;转录组;基因表达;分子调控机制
浙江大学
博士
蔬菜学
曹家树
2012
中文
S634
154
2013-10-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）