EGCG对梗阻性肾病大鼠肾小管上皮细胞氧化损伤的保护机制研究
据研究，免疫-炎症-活性氧是引发许多肾病的重要机理，其中活性氧是主要的介导因子。肾脏是高灌注器官，血流量大、供氧丰富，是机体内最易产生活性氧的器官，因此抑制活性氧的产生及其造成的氧化损伤在肾病临床中有重要作用。免疫介导的炎症反应、缺血-再灌注、蛋白尿、高血糖等多种因素均可引起活性氧的暴发性发生;与此同时，病变肾脏的抗氧化系统失调，活性氧清除能力下降，氧化与抗氧化平衡打破，均可使活性氧大量积累，而累积的活性氧又极易损伤肾脏。因此，抑制活性氧产生及其所引发的损伤对保护肾脏有重要作用。
儿茶素是从绿茶中提取出来的一种多酚基化合物，且为植物产生的一种重要的天然高效、无毒、非酶抗氧化剂，儿茶素对多种肾病有一定的防治作用。诸多研究表明，儿茶素是高效活性氧清除剂，不仅直接清除活性氧，还可通过提高抗氧化酶活性、络合作用等多种途径增强抗氧化效果。L(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate EGCG)是儿茶素中抗氧化活性最强的单体儿茶素，它能否改善梗阻性肾病的氧化应激，目前尚未见报道。为此，本实验将利用单侧输尿管结扎模型，研究EGCG对肾组织抗氧化的作用，并探讨EGCG对肾脏抗氧化反应的作用机制，为临床上应用EGCG治疗梗阻性肾病提供依据。
肾小管上皮细胞氧化性损伤可见于各种肾脏疾患，因而寻求有效防治肾小管上皮细胞氧化损伤的措施非常必要。EGCG是儿茶素中抗氧化活性最强的单体儿茶素，能否影响H2O2刺激下肾小管上皮细胞活性尚未见报道。氧化损伤后肾小管上皮细胞能量代谢及细胞活力改变的机制目前还不清楚，本文采用H2O2作为外源性氧化剂，建立氧化应激模型，观察H2O2对培养的大鼠肾小管上皮细胞(NRK)的损伤效应，以及氧化应激对NRK细胞生物学行为的影响，以探讨其氧化损伤的机制。本实验还探讨了EGCG对NRK细胞氧化性损伤的保护作用，以了解EGCG对肾氧化性损伤疾病的保护机制，为临床治疗提供依据。
材料和方法：
一、动物模型与分组
雄性Wistar大鼠50只(120-150克，4-6周)，以随机排列表法随机分为:正常对照组（N组）10只，实施假手术;模型组（C组）10只，以单侧输尿管结扎复制梗阻性肾病模型;EGCG治疗组（T组）30只，该组在单侧输尿管结扎术后0h、24h、48h分别给予腹腔注射给药2.5mg/kg/day(T1)，5mg/kg/day(T2)，和10mg/kg/day(T3)。空白对照组和模型组均注射生理盐水。各组均在大鼠术后72h处死，每组处死10只。
二、细胞模型与分组
实验选取NRK52E大鼠肾小管上皮细胞株。筛选H2O2对NRK损伤的时间-剂量效应。实验分组:正常对照组;损伤对照组，按H2O2终浓度分为100μmol/L组、250μmol/L组、500μmol/L组、750μmol/L组、1000μmol/L组共五组，每个处理组又按H2O2作用时间分6h、12h、24h3个小组，筛选H2O2对NRK细胞损伤研究的最适剂量与最佳时点。然后将培养细胞分正常对照组(N)、损伤对照组(C)、不同浓度EGCG组，EGCG组按终浓度又分为5mg/L(T1)，10mg/L(T2)，20mg/L(T3)3个组进行培养，其中各EGCG组均用相同浓度的H2O2干预。
三、标本的采集和处理
动物造模术后72h给予10％水合氯醛0.3ml/kg腹腔注射麻醉，处死大鼠。腹部常规消毒，无菌条件下留取肾组织，以无菌生理盐水冲洗，剥离表面脂肪，滤纸吸干表面水分，一部分置4％多聚甲醛中固定，石蜡包埋，待做免疫组化，另一部分取肾组织1mm3置于2.5％戊二醛中固定，待做电镜，余下以消毒锡纸、纱布包裹，标记后置液氮罐内速冻，再转移至-80℃冰箱保存，待做Realtime PCR和Westernblot。
四、实验方法及检测指标
1、比色法测定肾组织中ROS、GSH、GSSG、总GSH含量及GSH/GSSG。
2、免疫组化法测肾组织和NRK细胞中Nrf2和γ-GCS蛋白质的表达。
3、实时荧光定量PCR法测肾组织和NRK细胞中Nrf2 mRNA和γ-GCS mRNA的相对表达量。
4、Western Blotting法测定肾组织和NRK细胞中Nrf2、γ-GCS蛋白表达量。
5、HE染色光镜观察肾组织病理改变。
6、透射电镜观察肾组织超微结构变化。
7、MTT比色法检测NRK细胞活力。
8、Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞仪检测细胞凋亡。
9、JC-1荧光探针观察NRK细胞线粒体膜电位变化。
10、比色法测定NRK细胞脂质过氧化产物丙二醛(MDA)和乳酸脱氢酶(LDH)释放量的变化。
五、统计学分析
统计资料采用SPSS15.0统计软件进行分析处理，计量资料以均数±标准差表示，采用单因素方差分析，进行正态分布及方差齐性检验，各组间两两比较采用q检验，以P＜0.05具有统计学意义。
结果：
1、肾组织中ROS、GSH、GSSG、总GSH的含量变化及GSH/GSSG比值的测定
与正常对照组相比，模型组中ROS、GSSG和总GSH明显增高(P＜0.01)，GSH/GSSG明显下降(P＜0.01)，而GSH差异无统计学意义。各治疗组与正常对照组比较，ROS、GSSG和总GSH较N组明显升高(P＜0.01)，而2.5mg(T1)组较模型组下降(P＜0.05)，5mg(T2)与10mg(T3)组较模型组明显下降(P＜0.01)。
2、EGCG对Nrf2与γ-GCS蛋白表达的影响
免疫组化分析结果:各组肾组织和NRK细胞中nrf2蛋白的表达，主要集中在大鼠肾小管上皮细胞核。与正常对照组相比，模型组及各治疗组平均光密度值显著增高(P＜0.01);而各EGCG治疗组与模型组比较，T1组平均光密度值升高(P＜0.05)，T2与T3组平均光密度值显著增高(P＜0.01)。
各组肾组织和NRK细胞中γ-GCS蛋白的表达主要集中在大鼠肾小管上皮细胞浆。与正常对照组相比，模型组和各治疗组平均光密度值显著增高(P＜0.01);而各EGCG治疗组与模型组相比较，T1组平均光密度值升高(P＜0.05)，T2与T3组平均光密度值显著增高(P＜0.01)。
3、EGCG对Nrf2 mRNA和γ-GCS mRNA表达的影响
Realtime PCR分析结果:与正常对照组比较，在肾组织和NRK细胞中模型组Nrf2 mRNA，γ-GCS mRNA升高(P＜0.05)，而各EGCG治疗组与模型组相比较，T1组较模型组升高(P＜0.05)，T2与T3组较模型组明显升高(P＜0.01)，提示EGCG可以上调Nrf2和γ-GCS的基因表达，且具有剂量依赖性。
4、EGCG对Nrf2与γ-GCS蛋白表达量的影响
Western blotting分析结果:与正常对照组比较，在肾组织和NRK细胞中模型组的Nrf2与γ-GCS蛋白表达明显升高(P＜0.01)，而各EGCG治疗组与模型组相比较，T1组较模型组升高(P＜0.05)，T2与T3组较模型组明显升高(P＜0.01)，提示EGCG可以上调Nrf2和γ-GCS的蛋白的表达，且具有剂量依赖性。
5、肾组织光镜观察的结果
HE染色观察结果:UUO模型组出现弥漫性肾间质炎细胞浸润，间质水肿，且伴有不同程度的肾小管上皮细胞肿胀、空泡变性，部分肾小管呈灶状萎缩，小管管腔闭塞和（或）扩张，部分肾小管腔内有蛋白或细胞管型，间质趋向纤维化，但肾小球无明显病变。治疗组肾小管上皮细胞颗粒变性，肿胀或仅有很轻微的局部病变。
6、肾组织超微结构改变
透射电镜观察各组大鼠超微结构:模型组肾组织损伤明显，可见凋亡小体，EGCG治疗组可以减轻梗阻所造成的肾小管上皮细胞凋亡的发生。
7、不同浓度不同时间的H2O2对NRK细胞存活率的影响
本实验选用的H2O2在100μmol/L组6h时即可引起细胞损伤(P＜0.01)，随着H2O2浓度的增加及作用时间的延长，NRK活力明显降低(P＜0.01)，存活率降低，凋亡数增加。可见H2O2对大鼠肾小管上皮细胞造成损伤呈时间-剂量效应。在以后的实验中，我们选用250μmol/L H2O2处理6h，复制氧化性损伤模型。
不同剂量EGCG对H2O2诱导的NRK细胞损伤作用的干预效果:250μmoL/L6h组H2O2可使NRK细胞的活性明显降低，而加入5mg/L EGCG组细胞活性高于正常对照组(P＜0.05)，而当EGCG浓度为10mg/L、20mg/L时细胞活性明显高于正常对照组(P＜0.01)。EGCG的保护作用在H2O2浓度为250μmol/L表现出剂量依赖关系。
8、H2O2诱导NRK细胞凋亡及EGCG的干预效果
Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞仪检测细胞凋亡:
(1)不同浓度H2O2（作用时间均为6h）诱导NRK细胞凋亡:随着H2O2浓度的增高，NRK细胞早期和晚期凋亡率均增加，呈浓度依赖性。当H2O2浓度达到1000μmol/L时，细胞晚期凋亡率高于早期凋亡率。
(2)不同作用时间的H2O2（浓度均为250μmol/L）诱导NRK细胞凋亡率的变化:随着H2O2与NRK细胞孵育时间的延长，细胞早期和晚期凋亡率均增加，呈时间依赖性。
(3)不同剂量EGCG干预后NRK细胞凋亡率的变化:与正常对照组细胞凋亡率（2.47±0.53）％相比，250μmol/L H2O26h干预组细胞凋亡率(22.53±2.29)％明显升高(P＜0.01)。与损伤对照组相比，EGCG各剂量组干预的细胞早期凋亡和晚期凋亡率均明显降低(P＜0.01)，分别为T1组（8.57±0.84）、T2组（5.09±0.71）、T3组（2.76±0.43）。且随着EGCG浓度的增高，NRK细胞凋亡比例逐渐降低，EGCG呈浓度依赖性抑制H2O2诱导的NRK细胞凋亡。
9、EGCG对H2O2诱导的NRK细胞线粒体膜电位改变的影响
将正常对照组的线粒体膜电位作为基准点，将各组与之相比后的比值作统计分析。损伤对照组H2O2的线粒体膜电位下降至刺激前的35.4％(P＜0.01)，随着EGCG各治疗组剂量的增加，线粒体膜电位逐渐回升，但在各个时间点，线粒体膜电位均显著低于H2O2处理前的正常细胞。
10、不同剂量的EGCG对H2O2损伤的NRK细胞MDA和LDH释放的影响
H2O2可以明显使NRK细胞的脂质过氧化加剧，而加入EGCG后，MDA生成减少，说明这种脂质过氧化被抑制。在EGCG作用浓度为5mg/L时，MDA生成减少，与损伤对照组比较差异显著(P＜0.05);在作用浓度为10mg/L、20mg/L时，NRK的脂质过氧化明显受到抑制，与损伤对照组比较差异更为显著(P＜0.01)。
250μmol/L H2O2处理6h后，NRK细胞存活率降低，细胞膜完整性遭到破坏，蓝色的LDH颗粒漏出到细胞外，与正常对照组有显著差异(P＜0.01)。在EGCG作用浓度为5mg/L时，LDH释放量下降，与H2O2损伤对照组相比有显著性差异(P＜0.05)，当EGCG作用浓度为10mg/L、20mg/L时，LDH释放量明显低于H2O2损伤对照组(P＜0.01)。
结论：
1、在梗阻性肾病大鼠肾组织中存在氧化应激，氧化应激可能通过上调Nrf2基因的表达而上调抗氧化酶γ-GCS的表达。
2、体内、外实验均证实，EGCG可以改善氧化应激所致的肾小管上皮细胞的损伤。
3、H2O2处理6h可复制肾小管上皮细胞氧化性损伤的模型，H2O2可造成NRK细胞的损伤及凋亡，不同剂量EGCG可从不同程度上减轻氧化剂对NRK细胞的损伤，对其具有保护作用。稳定线粒体膜电位可能是EGCG抗H2O2氧化损伤的机制之一。该模型为进一步探讨肾小管细胞氧化性损伤的机制，观察药物作用及机理奠定了基础。
4、EGCG能明显提高受损肾小管上皮细胞的有氧代谢，能促进其损伤后的修复，具有稳定细胞膜和保护肾小管细胞完整性的作用，这种作用与EGCG清除自由基、抑制脂质过度氧化密切相关。
梗阻性肾病;氧化应激;肾小管上皮细胞;损伤保护机制;EGCG
中国医科大学
博士
儿科学
吴玉斌
2009
中文
R692.2;R285.5
81
2013-10-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）