人巨细胞病毒UL149基因编码能力及编码产物结合多肽的氨基酸序列分析
人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)是疱疹病毒科的一种，人群普遍感染，绝大多数表现为无症状。然而，对于免疫缺陷病人，如艾滋病患者或器官移植患者，HCMV感染可以是致死性的;同时对于先天感染者，HCMV感染可以导致新生儿各种先天畸形和疾病，如巨结肠，肝炎综合征，小头畸形等等。HCMV的致病机理至今仍不明了。然而，HCMV在免疫系统功能缺陷和不完善的人群中的这种致病作用，提示HCMV的致病机制与免疫系统功能关系密切:一方面与宿主的免疫系统功能有关，另一方面与病毒的自身基因结构及与此相关的病毒复制能力、组织嗜性及病毒逃避机体免疫应答反应的能力等有关。
事实上，Toledo等临床分离株在病毒毒力和致病性方面明显比AD169、Towne等实验室株增强，小鼠动物模型研究[1]发现Toledo株比实验株AD169株复制水平至少高三倍。1996年，Cha等人从基因水平对临床低传代分离株与实验室株进行了比较，发现Toledo株比AD169株多了19个ORF（约15kb），依次命名为UL133～UL151，即UL/b'区，并由此推断，此UL/b'区与HCMV的致病性密切相关。随后的研究表明有关HCMV临床低传代分离株UL/b'区基因不仅高度多变，而且部分基因的多态序列存在着不同的基因型，如UL144，UL146，UL147等。除此之外，我们在对UL/b'区基因多态性的系列研究中，还发现UL139，UL149基因存在高度多态及基因分型。
然而，与HCMV致病性密切相关的UL/b'区基因功能的研究还比较少。UL141的编码产物可以通过与CD155结合来干扰NK细胞功能，进而来抑制其杀伤感染细胞的作用;UL142可以编码一种MHC-I类分子样物质，可以下调NKG2D的天然配体MICA，并且以一种克隆依赖的方式抑制NK细胞对感染细胞的溶解作用;UL144可以通过不同的方式干扰机体免疫应答反应:可以和B、T淋巴细胞衰减子BTLA结合，选择性模拟疱疹病毒入侵介质HVEM的抑制性共同信号功能，从而抑制T细胞的增殖;还可以通过TRAF6依赖的方式激活NF-κB，进而激活趋化因子CCL22的表达，最终导致HCMV逃避免疫监视作用。
人巨细胞病毒作为一种原核生物，其基因转录时表现的多顺反子特点，使HCMV的转录和表达更加多样化。研究人员对UL/b'区的基因多态性研究中更多地应用生物软件对基因的编码能力和功能进行了预测，但是与现有的实验研究的结果比较并不完全一致。这表明，病毒的蛋白产物在发挥其生物学方面是比较复杂的，仅通过病毒基因的核酸序列来推测其生物学功能也是不完全的，还应在实验的基础上来明确各病毒基因编码产物的生物学功能。
目前，还没有关于HCMV UL149基因编码产物生物学功能方面的研究报道。本文主要研究UL149基因的编码能力及与其蛋白质的结合配体的能力，初步探讨UL149基因在HCMV致病中的作用机制。
材料与方法：
一、标本来源
HCMV低传代临床分离株3株来自我院1988-1993年间住院患儿，4株来源于我院2006-2007年住院确诊为HCMV感染相关疾病患儿。分离株-70℃冻存。
二、实验方法
（一）标本处理
1、提取RNA标本取自病毒分离实验，将HCMV病毒感染的人胚肺细胞溶解在Trizol试剂中，采用氯仿/异戊醇法抽提。
2、提取DNA标本取自病毒分离实验，取分离株上清与等体积裂解液混合，煮沸15分钟，离心数秒。
（二）RACE法扩增UL149基因mRNA
1、根据Toledo株序列，应用软件Primer premier5.0设计UL149基因特异性RACE扩增引物。
2、应用Takara3'-Full RACE Core Set Ver2.0 Kit及5'-Full RACE Kit，按说明进行操作。琼脂糖电泳检测、PCR纯化、T-A克隆测序
3、序列结果分析序列分析软件DNAClub，Bioedit，DNAStar等。
（三）随机多肽文库筛选与不同基因型UL149蛋白具有结合能力的多肽氨基酸
1、不同基因型UL149-GST融合蛋白的克隆
2、融合蛋白的表达融合蛋白UL149-GST的纯化
3、随机多肽文库筛选4、多肽克隆质粒中插入序列的测序及随机多肽区域氨基酸序列分析
5、应用Clustral X软件进行筛选多肽的氨基酸序列同源性比较
6、已知蛋白数据库的氨基酸序列比较
结果：
一、HCMV UL149基因编码能力结果
1、4例HCMV低传代分离株中UL149基因3'RACE-RT-PCR检测结果均为阳性，且含有2个片段，一个片断长约为500bp左右，另一个片断长约1000-1200bp;
2、4个标本的3'RACE扩增结果序列分析表明UL149基因均有不同长度的转录，随后连接来源于UL150基因区域的反向互补序列，来源于UL140、US7基因区域的反向互补序列，以及来源于人基因组的Homo sapiens adaptor-relatedprotein copmplex2，mul，subunit序列;序列结尾附带相近的分支信号TTAAT、TAA、TAAAAATAAA、TAAA等，以及polyA结构;剪接信号多数符合GT/AG原则，但是还有不典型的信号AG/CC、CG/CA、CA/GG、AT/GG，以及重复序列CGGCTACAGC、TGCGGGA、GCTCC等。
3、2例标本5'RACE-RT-PCR结果阳性。
二、HCMV UL149蛋白结合多肽氨基酸同源性分析
多肽文库筛选实验共得到UL149Ⅰ型蛋白的结合多肽序列17个，Ⅱ型蛋白的结合序列14个，Ⅲ型蛋白的结合序列36个，由三种基因型蛋白的筛选序列之间结构同源性较高，存在结构相似的区域，即W/A/F/V-D/E-D/E-G-W/F/I/L。
三、HCMV UL149蛋白结合多肽氨基酸与已知蛋白数据库比较
结果：
1、人免疫球蛋白重链可变区
在三种基因型的UL149蛋白筛选出的67个结合多肽的氨基酸序列中，共有39个序列显示与人免疫球蛋白重链可变区同源，并且占据抗原结合位点或异源二聚体结合位点，占58.2％:其中在Ⅰ型蛋白的结合多肽中有13个序列，占76.5％(13/17)，在Ⅱ型蛋白的结合多肽中有8个序列，占57.1％(8/14)，在Ⅲ型蛋白的结合多肽中有18个序列，占50.0％(18/36)，说明三种基因型UL149蛋白的结合多肽均与与免疫球蛋白重链可变区具有密切关系。
2、其他
具有较多同源性的结合多肽序列还有锌指蛋白、SH3结构域、补体因子H、丝氨酸/色氨酸蛋白激酶、WD结构域、核因子、MHC-I类分子等
结论：
1、HCMV UL149基因在临床低传代分离株中具有表达活性，存在多个转录子。
2、HCMVUL149基因区域可能存在可变剪接。
3、HCMV UL149三个基因型编码的蛋白质结合多肽氨基酸具有较高的同源性，存在结构相似的区域，即W/A/F/V-D/E-D/E-G-W/F/I/L。
4、HCMV UL149蛋白结合多肽与人免疫球蛋白重链可变区、丝氨酸/色氨酸蛋白激酶、补体因子H、MHC-(I)类分子等具有较高的同源序列，提示UL149蛋白可能参与免疫逃避作用;UL149与SH3结构域、锌脂蛋白、WD结构域具有同源序列，提示UL149蛋白还可能参与基因的转录、表达的调控、蛋白质合成以及信号转导、分子间相互作用等生物学过程。
人巨细胞病毒;UL149基因;编码能力;结合多肽氨基酸;生物学功能;致病作用
中国医科大学
博士
儿科学
阮强
2008
中文
R373.9
73
2013-10-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）