MicroRNA和组蛋白去乙酰化在皮肤中的作用研究
位于基因组非编码区的微小RNA(microRNAs or miRNAs)，在RNA聚合酶Ⅱ的作用下转录生成上千个核苷酸的初始转录产物（pri-miRNA），经特异性核酸内切酶RNaseⅢ（又称Drosha酶）加工，剪切成长度约60～100个核苷酸，具有发夹结构的微小RNA前体（pre-miRNA）。微小RNA前体在转运蛋白-5(exportin-5)协同下从细胞核转运到胞质中，被Dicer酶加工，切除茎环结构，剩下长约22个核苷酸的双链微小RNA。RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)捕获双链微小RNA，降解其中一条链，保留另一条链用来识别靶mRNA序列，这一步骤与加工合成siRNAs的过程相似。成熟的微小RNA抑制靶mRNA的表达可通过两种依赖于序列互补性的机制来实现。若两者序列不完全互补，抑制mRNA翻译成蛋白质，不影响mRNA水平的表达;若两者序列完全互补（或者几乎完全互补）则往往引起靶mRNA降解。
目前，在人类基因组中已经被确定的微小RNA达到了695个，同时有超过1000个微小RNA被预测，编码这些微小RNA的基因大概占了人类基因组的三分之一。在小鼠实验中，已确定了近50个微小RNA分子在皮肤上表达。这就意味着在人类的皮肤中微小RNA同样占有一定的显著比例并且发挥着不可替代的功能。
越来越多的证据表明，在表皮中成熟的有功能的微小RNA的存在已被证明是皮肤疾病包括皮肤肿瘤、瘢痕、银屑病和皮肤创伤愈合的发展的必要条件。
作为表观遗传学调控的另一个重要组成部分，组蛋白乙酰化和组蛋白去乙酰化酶通过影响染色体的结构进而调控基因的表达水平。而且组蛋白去乙酰化还可以通过调控非组蛋白，例如多种转录因子，进而调控基因的表达，进而影响疾病的发展，包括皮肤疾病。
已经有报道称组蛋白去乙酰化酶参与到了皮肤的发育和皮肤疾病，例如银屑病的发展过程中。另外，组蛋白去乙酰化酶抑制剂作为新的皮肤肿瘤治疗手段也已经进入到了临床试验阶段。尽管如此，组蛋白去乙酰化酶抑制剂治疗皮肤肿瘤的细胞和分子机制还不清楚。特别值得提到的是，组蛋白去乙酰化-微小RNA相关的调控网络在包括皮肤肿瘤、银屑病在内的皮肤疾病的发生和发展中的作用仍是一个热点问题。
材料和方法:
一、研究对象
论文一、10例患者来自美国密歇根州亨利福特医学中心皮肤科皮肤美容门诊。其中男性5例，女性5例，年龄从24～58岁之间。瘢痕面积4％～60％，治疗面积120～455cm2，包括了颈部，胸部，臂部，腹部及腿部。符合病程一年的标准。
论文二及三、实验用HaCaT角质细胞系来自美国密歇根州亨利福特医学中心皮肤科实验室，人原代表皮角质细胞购买于美国Life Technology公司。
论文四、遗传系血管性水肿家系来自中国医科大学附属第一医院皮肤科门诊，其中男性患者血样5份，女性患者血样6份。患者年龄从11～61岁之间，所有患者均采集年龄、性别、家族史，疾病史等信息。
二、实验材料
血液基因组DNA提取试剂盒（细胞裂解液CL、蛋白酶K、缓冲液GB、无水乙醇、去蛋白液GD、漂洗液PW、洗脱液TB、吸附柱CB3）、TBE缓冲液(Tris碱、EDTA、硼酸、ddH2O)、琼脂糖、引物、2×Taq Plus PCR MasterMix聚合酶。Qiagen miRNeasy Mini kit、 ABI公司TaqMan(R) MiRNA逆转录试剂盒、TaqMan(R)MiRNA Multiplex RT Assays, Human pool A(v2.1)和pool B(v3.0)、HumanMicroRNA array card, plateA(v2.1)和plate B(v3.0)、TaqMan(R) MicroRNA Assay。
三、实验方法
1、提取瘢痕患者治疗前后全层皮肤组织及细胞实验治疗组和对照组RNA，结合相应特异性引物进行RT-PCR反应，从SDS2.3和RQmanager1.2分析获取Ct值。
2、MTT分析细胞增值情况;流式细胞仪分析细胞凋亡率（AnnexinV染色）;使用Lipofectamine RNAIMAX转染miRNA前体;Western-blot分析BCL-2蛋白表达。
3、采集遗传性血管性水肿家系患者及健康对照5ml全血，结合C1INH引物进行PCR反应，使用Sequence Analysis软件分析血细胞DNA突变。速率散射比浊法测定血清中C4以及C1INH浓度，ELISA法测定血清中C1INH功能。
四、统计学分析
所有统计学分析过程均采用GraphPad Prism5.0软件完成。统计方法如果未加说明则是t检验。P＜0.05即具有统计学意义。
结果:
一、CO2点阵激光作用于烧伤性癜痕引起的临床和生物化学效应
(1)治疗后病人及观察者评分分数明显降低。治疗后患者和观察者及温哥华瘢痕评分分数明显降低(P＜0.001);
(2) CO2点阵激光治疗明显降低Ⅰ型（P＜0.01）和Ⅲ型(P＜0.001)胶原蛋白的表达，但是Ⅰ/Ⅲ胶原蛋白的比率不变;
(3) CO2点阵激光治疗明显增加基质金属蛋白酶-1的表达(P＜0.001)，但是基质金属蛋白酶-13的表达不变;
(4) TGF-β1的表达治疗前后不变，但是TGF-β2和-β3的表达明显降低，治疗后碱性纤维细胞生长因子的表达降低(P＜0.05);
(5)治疗后非编码基因miR-18a(P＜0.01)和miR-19(P＜0.05)表达明显增多。
二、三氧化二砷作用皮肤角质细胞引起的微小RNA改变
(1)三氧化二砷以时间和剂量依赖的形式抑制了HaCaT细胞系和人原代皮肤角质细胞的生存能力;
(2)三氧化二砷改变了HaCaT细胞系的miRNA表达谱，共有13个miRNAs表达降低和20个miRNAs表达升高（|-△△Ct|≥2）;
(3) HaCaT细胞系中mR-10a，miR-212，miR-29b和miR-660的表达被证实降低，原代表皮角质细胞中miR-212和miR-29b的表达被证实降低。
三、组蛋白乙酰化酶抑制剂，曲古抑菌素A诱导的miR-449过表达通过靶点BCL-2α介导皮肤角质细胞凋亡
(1)曲古抑菌素A以时间和剂量依赖的形式抑制HaCaT细胞系和人原代皮肤角质细胞的生存能力;曲古抑菌素A在不同时间点诱导HaCaT细胞系凋亡;
(2)曲古抑菌素A改变了HaCaT细胞系的miRNA表达谱，共有15个miRNAs表达降低和18个miRNAs表达升高(|-△△Ct|≥3); HaCaT细胞系中miR-212，-194，-9，-95，-449a and miR-449b的表达被证实升高;
(3)转染miR-449a前体诱导了HaCaT细胞系的凋亡，转染miR-9和miR-95不能够干扰HaCaT细胞系的生存能力;
(4) BCL-2α在转染miR-449a的HaCaT细胞系中表达降低;结合已发表文章，证实BCL-2α是miR-449a的直接靶点。
四、一个遗传性血管性水肿家系基因突变分析及蛋白浓度和功能测定
(1)家系内患者C1INH基因第8外显子上的一个新的移码突变被发现，正常对照则没有发现任何突变;
(2)突变蛋白由原来的500个氨基酸变为556个，并且蛋白的活性中心消失;
(3)患者血清中补体C4及C1INH浓度降低，C1INH功能降低有缺陷，正常对照血清蛋白浓度及功能均在正常参考值范围内。
结论:
1、表观遗传学调控，包括了miRNA和组蛋白乙酰化在皮肤肿瘤的发生中起到重要作用。
2、二氧化碳点阵激光能够明显改善了成熟烧伤瘢痕的情况;降低的Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白、TGF-β2、TGF-β3和碱性纤维细胞生长因子，以及表达增加的基质金属蛋白酶-1、非编码基因miR-18a和miR-19可能和临床效应的机制相关。
3、miRNA参与了三氧化二砷诱导的皮肤角质细胞改变;其中miR-10a，miR-212，miR-29b和miR-660可能在三氧化二砷引起的皮肤角质细胞改变中起到重要作用。
4、miRNA在曲古抑菌素A介导的皮肤角质细胞改变中起到重要作用;其中 miR-449a和直接靶点BCL-2α通路在曲古抑菌素A诱导的皮肤角质细胞凋亡起重要作用。
5、位于患者C1INH基因第八外显子上的移码突变造成的C1INH蛋白浓度和功能降低导致了家系内遗传性血管性水肿的发病。
微小RNA;曲古抑菌素A;角质形成细胞;皮肤肿瘤;三氧化二砷;细胞增生;细胞凋亡
中国医科大学
博士
临床医学;皮肤性病学
何春涤
2013
中文
R739.5;R730.5
77
2013-10-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）