东北三省猪场S.suis感染状况调查及S.suis7比较蛋白组学研究
猪链球菌（Streptocccus suis，S.suis）是一种重要的人畜共患病原。根据其荚膜多糖抗原特性差异可将其分为35种血清型（1-34型，1/2型），其同一血清型不同菌株之间以及不同血清型之间的毒力均有差异，不是所有的血清型均有致病性，也不是同一血清型的分离株都能引起相同的疾病。在养猪产业，S.suis感染是世界范围的问题，它能引起猪脑膜炎，关节炎，肺炎，心内膜炎，流产以及仔猪的突然死亡。该病给养猪业造成的危害较大，是危害西方发达国家养猪业的三大细菌传染病之一，也是多年来一直困扰中国养猪业发展的主要传染病之一。同时，S.suis还是一个被忽视的新发人类病原体，能导致人类脑膜炎、心内膜炎、肺炎、关节炎、败血症及突然死亡的人兽共患病原体。在越南S.suis是导致成人脑膜炎的主要原因，其次是在泰国和香港。2005年，中国有一次重要的爆发，有200多人感染，死亡率达20％;病人表现为中毒性休克综合症，症状为高烧、全身乏力、恶心、呕吐;在严重病例里还出现皮下出血及昏迷等症状。
由于1998年和2005年的人感染S.suis的爆发，多数研究学者把研究重点都集中在南方的分离菌株上，对北方分离菌株研究的很少。为了明确S suis在中国东北地区流行菌株的分布、流行的血清型、毒力的进化及毒力进化的机制，我们在东北地区的黑龙江省、吉林省和辽宁省3个省的23个市县的养猪场无菌条件下采集了鼻拭子2204头份和血液1666份对，对各猪场S.suis的感染状况进行调查;同时对黑龙江省、吉林省、辽宁省部分地区送检的疑似S.suis感染病料组织，通过PCR方法及血清学方法进行了S.suis病原的检测及分离鉴定，结果从23个健康猪场的样品中均检测到链球菌，并分离出155株猪链球菌，其中猪链球菌(1)型菌株分离到7株，猪链球菌2型菌株分离到39株，猪链球菌7型菌株分离到4株，猪链球菌9型菌株分离到11株，其他型猪链球菌菌株分离到94株;在发病猪感染病料组织里共分离到12株猪链球菌，其中猪链球菌2型10株，猪链球菌7型1株，猪链球菌9型1株。多数分离株在血平板培养基上形成灰色、半透明、边缘整齐的带有草绿色狭窄溶血环的光滑型圆形小菌落，革兰氏染色后镜检可观察到散在排列的革兰氏阳性短链球菌。对S.suis进行分离鉴定的同时，对从黑龙江省鹤岗、讷河、佳木斯、克东、大庆、牡丹江等地区正常猪群采集的血清样品571份，从吉林省5个地区的5个猪场正常猪群采集的血清样品443份，从辽宁省抚顺、盘锦、营口、旅顺、本溪、辽河、开原等正常猪群采集血清样品652份，用本实验室自己表达的GDH蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA方法对采集的血清样品进行猪链球菌抗体的检测，结果黑龙江省各猪场的猪链球菌抗体阳性率分别为27.5％、35％、41％、25％、20％、70％，抗体阳性率低与各地S.suis的分离率低相符合;吉林省各猪场的猪链球菌抗体阳性率分别为37％、69％、67％、71％、60％，各猪场的抗体阳性率高与各猪场的S.suis分离率高相符合;辽宁省各猪场的猪链球菌抗体阳性率分别为97％、97％、55％、68％、81％、79％，各猪场都注射了疫苗，免疫效果较好而起到相应的保护作用，与各猪场S.suis的分离率低相符合;所建立的方法灵敏度高，特异性好，适合于临床血清样品抗体的检测。随后，我们测定了12株来源于病料的分离株的7个管家基因，测序结果通过GenBank数据库进行BLAST分析，并将7个管家基因位点的序列片段上传至多位点序列分型数据库进行比对，确定菌株的序列型(Sequence type，ST)，结果在猪链球菌2型分离株的MLST比对中发现，来源于不同区域的4株猪链球菌2型分离株与四川省和江苏省人感染病例分离株98012和05zy一样属于ST7型，而另外6株猪链球菌2型分离菌株与猪链球菌2型高致病性的世界大流行P1/7同属于ST1型;ST1型和ST7型都是ST1克隆复合体的成员，两者关系紧密，7个位点中只有1个位点存在差异。同时我们发现另外2株分离株（1株猪链球菌7型，1株猪链球菌9型）的ST型是猪链球菌MLST数据库中没有的即新的ST型，其等位基因图谱分别为8，30，5，34，9，3，25和45，56，1，15，57，52，55，这些新的数据都已上传猪链球菌MLST数据库，结果将丰富猪链球菌MLST数据库，为各国研究者所利用;对这些分离株进行遗传进化分析，了解这些流行菌株的变异情况，研究其变异规律。
为探索不同毒力猪链球菌7型菌株进化的分子基础，本研究在猪链球菌7型流行病学调查的基础上，对分离到的不同致病力的猪链球菌7型菌株进行了比较蛋白组学的研究，通过质谱鉴定的手段共识别出我国猪链球菌血清7型不同毒力流行菌株的胞外差异蛋白质点23个，将差异蛋白挖点后进行质谱鉴定，结果得到成功鉴定的有18个蛋白质点，由于在胶上有多个点对应一个蛋白现象的存在，这18个蛋白质点代表13个独立的蛋白质，这些蛋白质多是参与糖酵解、糖代谢、蛋白质合成和基因表达调控的关键酶。在13个蛋白质里我们选取了10个蛋白质的基因通过RT-qPCR方法进行了mRNA水平上的验证，结果这10个差异蛋白基因在mRNA水平上都有表达，其中有9个基因的表达量差异显著(p＜0.05)，RT-qPCR的结果与双相电泳的结果一致。分析比较蛋白质组学结果及后面的RT-qPCR验证结果，并与不同菌株的致病力相结合，我们将6-磷酸果糖激酶，30S核糖体蛋白，分支酸合酶，胞外溶解蛋白家族5，丙酮酸激酶，核糖磷酸焦磷酸激酶，核糖体再循环因子，翻译延长因子，磷酸丙糖异构酶等9个蛋白定义为不同致病力猪链球菌7型菌株之间的差异表达蛋白，它们的生物学功能分别是6-磷酸果糖激酶具有加速糖酵解的作用;30S核糖体蛋白主要是释放tRNA的部位;分支酸合酶是莽草酸代谢途径里的第7个酶，能催化5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸分支酸转化成分支酸;胞外溶解蛋白家族5具有类似分子伴侣的活性，能携带毒素等小分子物质进出细胞;丙酮酸激酶能使磷酸烯醇式丙酮酸和ADP变为ATP和丙酮酸，是糖酵解过程中的主要限速酶之一;核糖磷酸焦磷酸激酶是多种生物合成过程中的关键酶;核糖体再循环因子能参与肽链合成终止之后的核糖体复合物的解体;翻译延长因子主要是翻译作用，但有学者发现肿瘤细胞中比正常细胞中表达量高30倍;磷酸丙糖异构酶能催化磷酸二羟丙酮转化成3-磷酸甘油醛，使之进入糖酵解途径。这些差异蛋白是否影响了菌株的毒力，我们通过基因敲除的方法对差异蛋白功能验证（这部分内容的具体数据由本实验室其它研究生进行具体论述）。
猪链球菌7型;分离鉴定;流行病学调查;比较蛋白质组学;差异表达蛋白
东北农业大学
博士
基础兽医学
张秀英
2013
中文
S858.28
68
2013-10-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）