J亚群禽白血病病毒分离鉴定及间接ELISA方法建立和初步研究
禽白血病(Avian leukosis，AL)是由禽白血病病毒(Avian leukosis virus，ALV)和禽肉瘤病病毒(Avian sarcoma virus，RSV)所引起的禽类肿瘤性疾病的统称。病毒所致肿瘤类型较多，大多为传染性的良性及恶性肿瘤。其中，J亚群禽白血病(Subgroup J avian leukosis)是由反转录病毒科的J亚群禽白血病病毒(Avian leukosis virus of subgroup J，ALV-J)所引起的一种以侵害肉鸡为主的肿瘤性疾病。
本实验对临床疑似感染鸡进行临床检查，剖检发现肝脏肿大表面有白色结节，被膜下有血块，肾脏肿大明显，表面有肿瘤结节。病理组织学检查肝脏有弥漫性髓细胞样瘤细胞浸润，肾脏分布局灶性髓细胞样瘤细胞。间接免疫荧光鉴定病毒感染DF-1细胞出现阳性特异性荧光，ALV-J gp85基因PCR鉴定正确，表明成功分离鉴定1株ALV-J。根据NCBI发表的禽白血病基因序列，针对gp85基因设计引物，从疑似感染鸡病料中提取前病毒DNA，PCR扩增出924 bp的目的条带，利用原核表达载体pET-30a(+)构建重组质粒pET-gp85，经酶切和测序鉴定正确后转化入E.coli Rosetta感受态细胞中进行IPTG诱导表达，经SDS-PAGE分析，表达的蛋白以包涵体形式存在，重组蛋白大小为40 kDa。经Western blot检测分析，结果表明该pET-gp85蛋白具有良好的反应原性。
将pET-gp85蛋白经镍柱纯化复性后作为包被抗原，建立检测ALV-J-gp85抗体的间接ELISA方法，并对间接ELISA方法工作条件进行优化。结果表明，封闭液浓度为1％ BSA;抗原包被量为1μg/mL;血清稀释度为1∶400;血清作用时间为1 h;二抗稀释度为1∶4000;二抗作用时间为1 h;底物显色时间为10 min。经重复性试验、特异性试验和临界值确定结果显示，建立的检测方法有良好的重复性，与马立克病毒、传染性支气管炎病毒、大肠杆菌、沙门氏菌等阳性抗体均无交叉反应，表明该方法具有良好的重复性、特异性、敏感性，通过对临床大量样品的检测，得到较为科学的阳性率，可以为临床检测ALV-J提供依据。
J亚群禽白血病病毒;肉鸡;gp85基因;分离鉴定;原核表达;间接ELISA方法
东北农业大学
硕士
基础兽医学
李广兴;刘永刚
2013
中文
S852.659.3;S858.31
65
2013-10-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）