番茄E8基因启动子功能域分析及PGENE转化番茄研究
诺如病毒(Norovirus，NV)是导致人类非细菌性急性胃、肠炎的主要病原。疫苗是临床防治诺如病毒疫情爆发的重要手段之一。对比诺如病毒的病毒样颗粒（virus-likeparticles，VLPs）和P颗粒(Pparticles)与人组织血型抗原(humanHisto-BloodGroupAntigen，HBGA)亲合力的研究发现，P颗粒的免疫原性要强于VLPs，因此我们设计用植物系统表达P颗粒，通过直接食用进行粘膜免疫起到防治诺如病毒疫情的作用。并且，利用植物生物反应器生产外源蛋白具有安全性高、毒性低和易规模化生产的优势。直接食用还省去了分离纯化的过程，大大降低了生产成本。
E8基因启动子(E8promoter)在番茄果实成熟早期调控E8基因在果实中特异地表达和对植物荷尔蒙-乙烯的应答。因其在成熟果实中特异性的表达，所以是用来在番茄成熟果实表达诺如病毒P颗粒的理想的基因工程工具。
本研究首先以CaMV35S启动子和E8全序列启动子作对照，通过分别缺失E8启动子的-2181到-1528(Delα)，-1528到-1088(Delβ)，-1088到-863（Delγ），-863到-409(Delδ)，-409到-263(Delε)和-263到-1(Delξ)等六个区域，以绿色荧光蛋白基因(变种mgfp5)为驱动报告基因构建载体质粒，转化番茄品种黄樱桃番茄NO.22，经PCR和Southernblot确认获得了独立的转基因番茄;检测转基因番茄缺失不同区域对报告基因在转录和翻译水平的影响以及在不同组织中表达特异性的影响。
根据Real-timePCR结果显示，E8启动子分六个区域功能区，α和δ两个区域的缺失基本上不影响报告基因在番茄各组织中的表达;γ和(ξ)两个区域的缺失虽然影响报告基因在番茄熟果中的表达，但调高了报告基因在番茄其他组织中的表达，如γ区域的缺失调高了报告基因在番茄青果中的表达，(ξ)区域的缺失调高了报告基因在番茄叶中的表达;β和ε两个区域对报告基因在番茄熟果中的表达影响非常大，应该是E8启动子重要功能区。
然后，我们根据番茄偏爱密码子设计合成了表达诺如病毒毒株VA387的P颗粒的Pgene(1002bp)，并在其5'端融合了编码His-tag(6×His)的DNA序列。构建了含Pgene的原核载体，转化大肠杆菌（Escherichiacoli）菌株DH5α，在此基础上，将Pgene置于E8启动子下游，构建了植物双元表达载体质粒E8::Pgene，并获得了含该质粒的农杆菌EHA105;通过农杆菌介导法转化番茄品种黄樱桃番茄22号（Lycopersiconesculentumvar.cerasiformeyellowcherryNo.22），并在相应培养基和条件下进行共培养、筛选和驯化，获得抗性再生的109株，经PCR和Southernblot确认获得了6株独立的转基因番茄;转Pgene番茄的RT-QPCR分析结果显示，Pgene在转录水平上进行了表达，在成熟果中表达量达到最高;经westernblot分析，转基因番茄果实表达的P粒子具有免疫活性;这为临床应用诺如病毒口服疫苗研制做了前期的准备，为利用植物系统研制口服疫苗提供了参考。
诺如病毒;番茄E8基因启动子;功能域;病毒样颗粒;人组织血型抗原;粘膜免疫
上海交通大学
博士后
园艺学
赵凌侠
2012
中文
S641.2;S603.4
75
2013-10-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）