视黄醇结合蛋白的纯化、抗血清的制备和检测方法的建立
视黄醇结合蛋白(RBP)对肝脏、肾脏等疾病的诊断治疗及预后监测具有重要意义。临床上RBP多采用适用于全自动生化分析仪的试剂盒进行检测，但目前RBP检测试剂盒大多为进口产品，价格昂贵，增加了检测的成本，制约了临床的推广应用。因此，国产试剂盒的研制具有重要的临床价值。本文在已有的研究背景下，综合考虑经济、操作等因素，开发出了一条新的RBP检测试剂盒的研制路线，为RBP国产试剂盒的试生产奠定了基础。
本文以肾衰患者的新鲜尿液为原料，利用硫酸铵盐析法对尿液中的RBP蛋白进行分离提取，得到RBP蛋白的粗提物。通过单因素实验及正交试验对不同的蛋白溶液饱和度、盐析温度、盐析时间等条件进行优化，得到RBP蛋白的最佳盐析工艺条件，此时RBP蛋白的提取浓度达到2.46mg/mL。通过验证实验，证实该条件下RBP的提取量最高。
通过探索RBP蛋白粗提液的分离纯化工艺路线，确定QSepharoseFastFlow柱层析和Superose12柱层析对RBP蛋白的纯化效果较好。利用单因素实验和正交试验研究不同实验条件对纯化效果的影响，得到两步柱层析法的最佳工艺条件。纯化后的蛋白溶液用全自动生化分析仪检测RBP浓度，用Tricine-SDS-PAGE电泳检测纯度，确定得到的蛋白分子量为21kDa，是所要提取的RBP蛋白。此时RBP蛋白浓度为1.8mg/mL，纯度为92％，计算得到产率为56％。
进一步采用纯化得到的RBP抗原免疫绵羊，颈动脉放血提取抗血清，并研究不同免疫时间对抗血清效价的影响，发现免疫8次后获取的抗血清效价较高，为1:16，用免疫电泳检验抗体纯度为95％，且具有特异性。然后用此RBP抗体建立了检测人血清RBP浓度的免疫透射比浊法，并且对该法的精密度、准确度、线性范围等进行分析，得到该法具有较好的性能指标，能够应用于全自动生化分析仪。
视黄醇结合蛋白;抗血清制剂;免疫透射比浊法;盐析工艺
南京理工大学
硕士
化学工艺
张春妮;董伟
2013
中文
TQ936.22;R392.7
57
2013-07-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）