Dact2在胃癌中的表观遗传学改变及功能研究
胃癌是威胁人类健康的恶性肿瘤性疾病之一，目前在世界范围内位于癌症相关死亡原因第二位。研究表明，Wnt信号通路的失调与消化道肿瘤的发生关系十分密切。Dact(Homo sapiens dapper，antagonist ofβ-catenin)是wnt/β-catenin信号通路的负性调节基因家族。Dact1和Dact3的表达均受到表观遗传学调控，分别在肝癌和结肠癌中通过调控wnt/β-catenin信号通路发挥抑癌基因的作用。但是Dact2在肿瘤中的作用文献报道很少。Dact2在胃癌中的表观遗传学变化及与胃癌发生关系至今尚无报道，能否成为胃癌的候选抑癌基因尚不清楚。
目的:本研究旨在检测Dact2在原发性胃癌和胃癌细胞系中的甲基化情况及表达改变，并结合临床病理资料探讨Dact2对胃癌早期诊断的临床价值；研究Dact2在胃癌细胞中的功能，分析其对Wnt信号通路的调控作用，探讨胃癌发生发展的可能机制。
方法:本课题选用了8株胃癌细胞系，分别是：BCG823、MGC803、N87、AGS、PHM82、SGC7901、NUGC3和MNK45。应用RT-PCR和Western blot的方法在7株胃癌细胞系中检测甲基转移酶抑制剂5-aza-2’-deoxycytidine(5-aza-dc)处理前后Dact2在mRNA及蛋白水平的表达变化；应用甲基化特异性PCR检测胃癌细胞系和原发性胃癌组织标本DNA中Dact2甲基化情况。通过转染Dact2真核表达载体恢复其在S胃癌细胞株SGC7901中的表达，观察Dact2对SGC7901的克隆形成、凋亡、周期、迁移的影响；应用荧光素酶报告基因系统，在胃癌细胞系SGC7901中检测Dact2对Wnt信号通路的调控作用；应用western blot检测Dact2表达对其下游效应蛋白(c-myc、MMP-2)的影响。为证实Dact2在活体中的抑癌作用，我们应用裸鼠成瘤实验观察Dact2对肿瘤生长的影响，计算抑瘤率进行统计学分析。
结果:应用甲基化特异PCR技术检测8株细胞系BCG823、MGC803、N87、AGS、PHM82、SGC7901、NUGC3和MNK45中Dact2甲基化状态，发现PHM82和SGC7901中Dact2存在完全甲基化改变。半定量逆转录PCR技术检测上述8株胃癌细胞去甲基化药物5-aza-dc处理前后Dact2 mRNA水平变化，发现在PHM82和SGC7901中Dact2 mRNA不表达，经5-aza-dc处理后恢复表达。结合MSP结果提示Dact2启动子区甲基化调控了其mRNA表达。在95例人原发性胃癌组织中，Dact2甲基化率达55.8％(53/95例)，而在正常胃黏膜中未见甲基化改变(0/7例)。为更好的理解Dact2在胃癌发生发展中的作用，我们采用Dact2表达载体转染胃癌细胞系SGC7901使Dact2再表达的方法，观察其潜在抑癌作用，发现Dact2能够降低SGC7901的克隆形成能力及迁徙能力，使细胞停滞在G2/M期，但是其对凋亡无明显作用。应用双荧光素酶报告基因系统，我们观察到Dact2对Wnt信号通路具有明显抑制作用。Western blot实验结果示Dact2再表达可能下调下游效应蛋白c-myc、MMP-2。在体外实验的基础上，我们进一步观察了Dact2对裸鼠成瘤的影响，发现Dact2能显著抑制活体内肿瘤的生长。
结论: Dact2启动子区甲基化是胃癌发生发展中的好发事件，可能参与下调了Dact2基因的表达；Dact2启动子区甲基化可能通过减弱对Wnt信号通路抑制作用影响胃癌发生发展，并可能成为诊断胃癌、评估预后的生物学标记物。
胃肿瘤;Dact2蛋白;表观遗传学;早期诊断
南开大学
博士
遗传学
杨云生
2012
中文
Q354;R735.2
90
2013-06-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）