应用糖蛋白组学技术对肿瘤特征糖蛋白的研究
本论文使用糖蛋白组学方法，对肿瘤细胞中糖蛋白进行分离纯化以及鉴定，力图寻找潜在的肿瘤标识分子，并对其在肿瘤行为中的功能进行初步的研究，为肿瘤的预后以及治疗提供可选靶点。
首先，使用小扁豆凝集度(LCA)对乳腺癌细胞系Hs578T以及同源正常乳腺细胞系Hs578BST中的糖蛋白进行了富集。应用二维电泳对比结合MALDI-TOF/TOF对差异蛋白进行鉴定。实验成功鉴定在两种细胞系中显著差异表达的糖蛋白22种，其中9种参与胶原蛋白的合成及修饰过程。脯氨酰-4-羟化酶二型α亚基(P4HA2)在乳腺癌细胞系中特异性表达，我们对其进行了深入的研究。首先使用realtime PCR以及免疫印迹技术，确定了P4HA2在Hs578T中的表达。应用免疫组化芯片在组织水平发现P4HA2在乳腺癌中的显著上调。最后，构建了P4HA2真核表达质粒以及应用RNA干扰发现，P4HA2的表达对Hs578T细胞的迁移和增殖能力具有抑制效果。
点击化学是指可以在不干扰生物正常生化进程的同时可以在生物体内进行的一系列化学反应的应用。这些应用扩展了人们对一系列生物分子的研究能力，包括糖，蛋白以及脂类。本实验合成了叠氮乙酰甘露糖胺(Ac4ManNAz)，其经细胞代谢以含有叠氮基团的唾液酸形式修饰于糖链末端。此外，实验合成了炔基标记的生物素探针，经由点击化学反应可将含有叠氮的糖蛋白生物素化。之后使用链霉亲和素标记磁珠分离生物素化蛋白。使用这一策略，我们从三种不同的腺癌细胞系，人肺腺癌A549、人宫颈腺癌HeLa和人胰腺癌SW1990中分离得到细胞表面糖蛋白。应用高分辨率液相色谱结合二级质谱(HPLC-MS/MS)分析，我们得到了三种细胞系中不同的糖蛋白表达图谱。经过生物信息学分析，共鉴定56种糖细胞表面糖蛋白被。随后，应用realtime PCR和免疫印迹的方法验证了其中部分蛋白在这三种细胞系中的表达。NrCAM是一种表达与神经系统的细胞表面粘附因子，在A549细胞中我们发现了这一蛋白的特异表达。经由免疫组化研究肺腺癌及正常肺组织，发现NrCAM不仅在非组织中有一定水平的表达，且在肺腺癌中的阳性率显著升高。但是在肺鳞癌中NrCAM的表达与正常组织却没有显著差异。同时在胰腺癌以及宫颈癌组织中并没有被检到NrCAM的表达，这与质谱鉴定的结果也相符。
基于Ac4ManNAz的糖蛋白代谢标记方法，本文随后对gp96蛋白在不同癌细胞系中的唾液酸化程度进行了研究。应用上述分离方法从Hela、A549和SW1990细胞中富集细胞表面糖蛋白，于富集组分中，发现gp96蛋白含量有显著不同。而在细胞水平观察gp96的表达并无显著差异。通过酶联免疫吸附反应分析gp96的生物素化和唾液酸修饰程度发现，SW1990中的gp96的生物素化以及唾液酸化水平比Hela与A549细胞系低约30％-40%。因此推论，gp96在不同癌细胞中存在唾液酸修饰上存在差异。在胰腺腺癌细胞SW1990中，gp96的唾液酸化程度的显著降低，可能直接影响其与免疫系统的相互作用。
糖蛋白组学;乳腺癌;肺腺癌;肿瘤特征;糖蛋白
南开大学
博士
微生物学
白钢
2012
中文
R730
167
2013-06-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）