SOCE通过Akt/Src/Rho GTPase信号通路参与Dhl-60细胞极性化的研究
背景：
中性粒细胞(Polymorphonuclearneutrophils，PMNs)是机体免疫系统的重要防御细胞之一。一旦中性粒细胞感知趋化因子的存在，可以迅速激活大量信号分子，瞬间形成头部宽大尾部狭窄的极性形态，并向趋化物或炎症部位发生定向迁移。中性粒细胞具有的这种感应炎症因子并向感染部位发生定向移动的功能，是其发挥抗炎灭菌的前提。在正常生理条件下中性粒细胞发挥着重要的抗炎免疫功能，但是如果在建立中性粒细胞极性化和趋化机制的任何一个环节出现调控异常都有可能导致中性粒细胞的异常激活，进而参与机体多种疾病病理的发生过程，如:败血症、哮喘、缺血/再灌注损伤、器官移植的排斥反应、动脉粥样硬化、病毒性心肌炎、类风湿性关节炎、过敏反应、一些炎症性皮肤病甚至肿瘤的发生和转移等。此外，中性粒细胞的极性化和趋化功能受限制或缺损，还可能会导致中性粒细胞懒惰综合征(lazyleucocytesyndrome，LLS)，中性粒细胞减少-胰腺机能不全综合征(Shwachman-Diamondsyndrome)以及丙种球蛋白异常血症（dysgammaglobulinemiatypeⅠ）。因此研究中性粒细胞的极性化和趋化功能的分子机制，对防治中性粒细胞功能异常导致的各种疾病及组织损伤具有重要意义。
细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)的变化被认为参与了中性粒细胞的应对各种外界刺激物的生理病理反应，如细胞的趋化和迁移，活性氧的产生等。针对中性粒细胞内钙离子浓度变化及外钙内流的调节机制已经研究了很多年，但是仍然存在矛盾的结论和很多不清楚的地方。近期有研究认为，中性粒细胞内钙信号可能来源于两种机制:(1)一种是受体介导的机制，即受体操纵的钙内流机制(receptor-operatedCa2+entry,ROCE);(2)一种是内质网钙库清空所介导的机制，即钙库操纵的钙内流机制(store-operatedCa2+entry,SOCE)。目前，ROCE机制的分子构成成份还不清楚，也缺乏针对ROCE机制研究的有效工具药，而针对SOCE机制的研究则比较清楚。SOCE机制最早于非兴奋性细胞被发现的，并被认为是参与非兴奋细胞内的钙内流活动的主要钙通道机制。到目前为止构成SCOE机制的两个蛋白分子已经被确认:(1)间质相互作用分子(stromalinteractionmolecule1，STIM1)，它作为一种钙信号感受器，可以感受内质网内钙的清空，并聚集和转位于内质网膜和细胞质膜相交处与其他分子共同构成一个钙通道;(2)Orai1（也称为CRACM1），它在细胞处于静息状态时散在的分布于细胞膜上，在细胞受外界刺激时被STIM1招募于内质网膜和细胞质膜相交处并结合于STIM1的C末端区域与STIM1共同构成钙通道。这些已经被证明的有关SOCE机制特征的研究结论有利于进一步研究SOCE在各种细胞功能中的作用。而且目前也已经有不少文献报道了SOCE通过调节细胞外钙内流参与到非兴奋细胞应对外界各种刺激因素所作出的反应，比如细胞极性化和趋化，细胞迁移以及肿瘤转移。体外及体内实验证明SOCE通过调节各种细胞内钙信号而调控了细胞极性化和趋化，有临床试验报道SOCE过分激活导致中性粒细胞功能亢进而最终引起组织损伤和炎症反应。SOCE在中性粒细胞极性化、趋化和呼吸爆发等过程中起着重要作用，但涉及到其中参与的具体信号通路尚不清楚。中性粒细胞在趋化物的刺激下由于蛋白和细胞器的转位而使得细胞发生不规则的极性形态变化和功能上的趋化，这种细胞极性化和趋化依赖于细胞对方向的感受，细胞可以感受到前后极相差～2％的趋化物梯度浓度，常见的趋化物如甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(N-formyl-Met-Leu-Pue，fMLP)，人白三烯(leukotrieneB4，LTB4)，血小板激活因子(platelet-activatingfactor,PAF)，白细胞介素8，IL-8），补体成分C5a(complementfactor5a)等，其中来源于细菌的多肽fMLP刺激作用最强。趋化物多通过作用于胞膜上的G-蛋白偶联受体而将胞外信号转化为胞内应答，但不同的趋化物受体可能选择性地作用于G蛋白不同的βγ亚单位从而作用于不同的效应器蛋白，因而在趋化和极性化效应上也表现出明显的差异。
fMLP、IL-8等趋化物在激活G蛋白偶联受体后，其作用的下游底物都可能参与到中性粒细胞的极性化和趋化过程中，比如磷酸肌醇3-激酶（phosphoinositide3-kinase，PI3K）及其磷酸化脂质产物，Rho小G蛋白，酪氨酸激酶，蛋白激酶C(proteinkinaseC，PKC)和有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPkinases，MAPK)。其中研究的比较成熟的经典的信号通路为PI3K依赖信号通路。在PI3K依赖信号通路中，刺激物fMLP，IL-8等，通过激活胞膜上的G蛋白偶联受体，并释放出亚单位Gβγ进一步激活PI3K，活化的PI3K可以将磷脂酰肌醇二磷酸(phosphatidylinositol3，4-bisphosphate，PIP2)磷酸化成磷脂酰肌醇三磷酸(phosphatidylinositol3，4，5-bisphosphate，PIP3)，聚集于趋化极性化细胞的前极，并在新重组的肌动蛋白(F-actin)处招募丝氨酸/苏氨酸激酶Akt(serine/threoninekinasesAkt,PKB)，使其两个位点发生磷酸化:丝氨酸473(serine473，Ser473)及苏氨酸308(threonine308，Thr308)。因此PI3K依赖性信号通路又叫做PI3K-Akt信号通路，而Akt的磷酸化也常常被作为PI3K依赖性信号通路激活的指标。但是近来有不少研究认为Akt与PI3K在细胞极性化机制的作用不能完全等同，然而到目前为此Akt与PI3K参与细胞趋化极性化机制的区别并不完全清楚，因此明确Akt在细胞极性化机制中的作用，有助于中性粒细胞异常极性化机制的进一步研究。
PI3K依赖性信号通路在细胞极性化机制中占有非常重要的作用，但近来有研究认为PI3K非依赖性信号通路协同PI3K依赖性信号通路共同参与了调节细胞极性化和趋化机制。Chodniewicz等认为趋化因子的不同，中性粒细胞的伪足伸展机制受控于PI3K依赖性信号通路和PI3K非依赖性信号通路所在比例各不相同。当趋化因子为fMLP时，伪足伸展的调控机制作用中有80％源于PI3K依赖性信号通路;当趋化因子为GM-CSF时，伪足伸展的调控机制作用中有60％源于PI3K依赖性信号通路;而当趋化因子为胰岛素时，对伪足伸展的调控机制作用中高达65％的比例是源于PI3K非依赖性信号通路。Geijsen等发现PI3K非依赖性信号通路激活的细胞趋化现象与PI3K依赖性信号通路激活的细胞趋化现象表现出一致性。这个PI3K非依赖性信号通路后来被认为是酪氨酸激酶类依赖性信号通路，比如Src依赖性信号通路。Src家族激酶(SFK)是一类非受体酪氨酸激酶家族，它包含c-Src，Fyn，Yes，Yrk，Lyn，Lck，Hck，Blk和Fgr的9个成员。其中Hck，Fgr，Lyn在细胞极性化和趋化中的作用已经被多次报道。比如有文献报道指出在各种环境刺激因子的作用下，中性粒细胞F-actin的调节伴随着Hck和Fgr活化水平的上调。动物实验中对小鼠进行Hck和Fgr基因敲除或用Src激酶特异抑制剂PP2预处理中性粒细胞后均会抑制fMLP刺激的细胞内Rac2活化及F-actin的聚集。
Rho小G蛋白家族，尤其是Rac1，Rac2和Cdc42通过调节细胞骨架聚集而参与细胞极性化和趋化的调节机制已经有很多文献报道过。这其中也不乏有矛盾和不确定的结论，然而刺激Rac1，Rac2和Cdc42活化的上游信号通路又有哪些呢？有研究发现PI3K抑制剂渥曼青霉素（Wortmannin）及LY249002或者酪氨酸激酶抑制剂高金雀花碱(genistein)均不能完全抑制fMLP刺激dHL-60细胞内的Rac或Cdc42活化。相反，PI3K或Src依赖性信号通路的激活都会引起Rac1和Cdc42的活化，促进细胞突起的形成，从而加强了结肠癌细胞的转移后的侵袭。此外还有研究报道了在梯度浓度CXCL8处理的中性粒细胞模型中，两条平行的信号通路，PI3K-ELMO-Dock2通路和Src-ELMO-Dock2通路共同参与了Rac2的活化和细胞极化趋化的调节。这些研究结果说明PI3K依赖性信号通路和Src依赖性信号通路共同参与Rac和Cdc42的活化的调节，从而进一步调控细胞极性化和趋化。那么在中性粒细胞中起着非常重要作用的SOCE机制与这些信号通路是否有某种关联呢？
目的：
以SOCE参与中性粒细胞极化趋化机制的调控作用为切入点，从fMLP趋化物刺激dHL-60(经二甲亚砜(DMSO)诱导分化的类中性粒HL-60)细胞或中性粒细胞极性化入手，通过浓度梯度和均匀浓度fMLP刺激的两种作用方式，观察SOCE抑制剂(SKF96365和2-APB)或STIM1的基因干扰后对dHL-60细胞和中性粒细胞形成的极性化的影响。通过Westernblot及GSTpull-down研究方法观察SOCE抑制剂(SKF96365和2-APB)及STIM1的基因干扰对fMLP刺激的Akt，Src，Rac1，Rac2及Cdc42活化的影响，找出可能参与SOCE调节细胞极性化的信号通路。
方法：
1.采用1.3％的DMSO诱导HL-60细胞0-6天，期间不换液，观察DMSO诱导每一天后细胞的密度，存活力，极化率和蛋白活化水平，得到最佳诱导天数。所得类中性粒HL-60细胞可用于本研究中的药物实验和基因干扰实验。
2.采用经典的密度梯度离心法分离中性粒细胞，主要包括红细胞沉降，淋巴细胞分离液密度梯度离心和低渗裂解液残存的红细胞三个步骤。首先葡聚糖T-500(dextranT-500)沉降红细胞可以除去绝大多数红细胞，淋巴细胞分离液密度梯度离心后可将外周血单核白细胞与多核白细胞分开，残存的红细胞可以通过低渗溶胀方法快速移除。获得的中性粒细胞进行吉姆萨染色和台盼兰染色，分析细胞活性和纯度，分别大于98％和95％。
3.用Zigmond小室建立梯度浓度的fMLP（0-100nM），观察细胞定向极化趋化变化。
4.用两种PI3K抑制（Wortmannin和Ly249002）和两种Akt抑制剂(AKTinhibitor和Deguelin)处理dHL-60细胞或中性粒细胞30min。观察其对fMLP刺激的Akt磷酸化的影响及细胞极性化的影响。
5.采用免疫荧光技术在激光共聚焦显微镜下检测fMLP刺激的Akt的活化和转位情况，以及Akt抑制剂(AKTinhibitor和Deguelin)对F-actin极性分布的影响。
6.采用GSTpull-down方法检测AKt抑制剂(AKTinhibitor和Deguelin)对Rac2活化的影响。
7.采用SKF96365和2-APB预处理dHL-60细胞30min，用Westernblot方法检测其对Akt和Src磷酸化的影响;用GSTpull-down方法检测其对Rac2，Rac1，Cdc42活化的影响，用Zigmond方法检测其对细胞定向极化趋化的影响。
8.电穿孔方法进行STIM1基因干扰，用Westernblot方法检测STIM1基因干扰后对Akt和Src磷酸化的影响;用GSTpull-down方法检测其对Rac2，Rac1，Cdc42活化的影响，用Zigmond方法检测其对细胞定向极化趋化的影响。
9.运用细胞内钙离子测定的方法检测SKF96365，2-APB以及STIM1基因干扰对TG刺激SOCE和fMLP刺激的钙内流的影响。
10.实验数据用均数±标准差（(x)±SD）表示，数据经SPSS13.0软件处理分析。三组及三组以上样本均数比较满足方差齐性用One-wayANOVA方差分析，组间两两比较采用LSD法;若方差不齐，采用welch检验，组间两两比较采用Dunnett'sT3法。P＜0.05为存在显著性差异。
结果：
1.与对照组相比，经fMLP刺激的dHL-60细胞或中性粒细胞的T308和S473两个位点的Akt磷酸化水平显著性升高(F=1364.033，68.711;P=0.010，0.027)。用Wortmannin，Ly249002，AKTinhibitor或Deguelin预处理dHL-60细胞和中性粒细胞后，与未预处理组相比，fMLP刺激的T308和S473位点的Akt磷酸化水平显著性降低(P=0.006，0.005，0.004，0.001;P=0.007，0.024，0.013，0.007)。
2.与对照组相比，dHL-60细胞或中性粒细胞经fMLP刺激后细胞极化率显著性上调(F=44.886，P=0.000)。用Wortmannin，Ly249002，AKTinhibitor或Deguelin预处理dHL-60细胞和中性粒细胞后，与未预处理组相比，fMLP刺激的细胞极化率显著性降低(P=0.000;P=0.000;P=0.000;P=0.000)。
3.静息状态时，T308/S473位点的磷酸化Akt蛋白和F-actin蛋白均散在分布于dHL-60细胞质膜上，fMLP刺激dHL-60细胞后，T308/S473位点的磷酸化Akt蛋白或F-actin蛋白呈极性不对称分布于质膜上。fMLP刺激的F-actin蛋白极性不对称分布在AKTinhibitor或Deguelin预处理后明显减弱甚或消失。
4.与对照组相比，经fMLP刺激的dHL-60细胞的Rac2的活化水平显著性上调(F=84.412，P=0.000)。用AKTinhibitor或Deguelin预处理dHL-60细胞后，与未预处理组相比，fMLP刺激的Rac2的活化水平显著性降低(P=0.000;P=0.000)。
5.与对照组相比，经fMLP刺激的dHL-60细胞的Akt和Src磷酸化水平显著性升高(F=46.189，59.140;P=0.000，0.000)。不同浓度SKF96365或2-APB预处理dHL-60细胞后，与未预处理组相比，fMLP刺激的Akt和Src磷酸化的水平大多数显著性降低(SKF96365:F=32.674，P＜0.005;F=63.195，P＜0.001;2-APB:F=6.957,P=0.109,0.002,0.004,0.000;F=99.486,P=0.000,0.000，0.092，0.000)，其中40μM的SKF96365和100μM的2-APB对fMLP刺激的Akt和Src磷酸化水平下调效果较好。
6.与对照组相比，经fMLP刺激的dHL-60细胞的Rac2，Rac1，Cdc42的活化水平显著性上调(ActivedRac2:F=79.242，P=0.007;ActivedRac1:F=51.064,P=0.000;ActivedCdc42:F=111.523,P=0.000)。SKF96365或2-APB预处理后，与未预处理组相比，Rac2，Rac1，Cdc42的活化水平显著性降低(ActivedRac2:P=0.022,P=0.016;ActivedRac1:P=0.000,P=0.000;ActivedCdc42:P=0.000,P=0.000)。
7.与对照组相比，电转染了controlsiRNA的dHL-60细胞在fMLP刺激后Akt或Src的磷酸化水平显著性上调(F=166.140，P=0.000;F=516.496，P=0.000)。电转染了两个不同STIM1siRNA片段组(STIM1siRNA1或STIM1siRNA2)，与电转染了controlsiRNA组相比，fMLP刺激后dHL-60细胞的Akt或Src的磷酸化水平显著性降低(P=0.000，0.000;P=0.000，0.000)。
8.与对照组相比，电转染了controlsiRNA的dHL-60细胞经fMLP刺激后Rac2，Rac1，Cdc42的活化水平显著性上调(ActivedRac2:F=26.680，P=0.000;ActivedRac1:F=62.941,P=0.013;ActivedCdc42:F=102.188,P=0.000)。电转染了两个不同STIM1siRNA片段组（STIM1siRNA1或STIM1siRNA2），与电转染了controlsiRNA组相比，fMLP刺激后dHL-60细胞的Rac2，Cdc42的活化水平显著性降低(ActivedRac2:P=0.021，P=0.001;ActivedCdc42:P=0.003,P=0.015)，而fMLP刺激后dHL-60细胞的Rac1的活化水平反而显著性升高(P=0.002;P=0.000)。
9.TG和fMLP均可以引发钙库清空和细胞外钙内流（通过在无钙的细胞外液中加入2mMCa2+来实现）两个钙峰，两种刺激剂作用前用SKF96365或2-APB预处理或者进行了STIM1基因干扰，均会抑制TG和fMLP激发的第二个钙峰细胞外钙内流，而对钙库清空没有影响。
10.SKF96365或2-APB预处理dHL-60细胞或中性粒细胞后，细胞定向极化率低于药物未处理组(dHL-60细胞:F=345.384，P=0.000，0.000;中性粒细胞:F=127.945,P=0.000,0.000)。
结论：
1.Akt在T308和S473两个位点的磷酸化在fMLP刺激的中性粒细胞或dHL-60细胞极性化中起重要作用。
2.SOCE在中性粒细胞或dHL-60细胞极性化中扮演不可或缺的作用，抑制SOCE可以显著的抑制fMLP刺激的中性粒细胞或dHL-60细胞极性化。
3.在fMLP刺激dHL-60细胞极性化过程中，SOCE通过对Akt和非Akt信号通路起作用，非Akt信号通路主要以Src分子为代表，即通过影响Akt，Src，Rac2，Cdc42的活化调控细胞极性化的发生。
钙内流机制;细胞极性化;信号通路;基因干扰;fMLP刺激
南方医科大学
博士
劳动卫生与环境卫生学
邹飞
2012
中文
R361.3;R557.3
106
2013-04-26（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）