食品中转基因成分的定量检测研究
随着转基因作物在全世界范围内的广泛种植，其食用安全和环境安全问题一直受到广大消费者和各国政府及相关机构人员的重视。很多国家和地区纷纷制定转基因生物安全管理法规，实施标签制度，并积极发展转基因食品检测监测技术。转基因食品检测技术的广泛应用导致阳性对照的需求量也在增加。传统标准分子的构建通常是以转基因材料与其对应的非转基因材料按一定的质量比例配制而成，从而获得一系列质量分数的标准品。然而，由于我国对转基因标准品的严格控制，许多转基因品系的标准样品很难得到。而包含有内源基因和外源基因以质粒形态存在的标准分子，具有稳定性好、用量少、易保存、易获得等优点，因此，构建阳性质粒标准分子作为转基因食品检测的阳性对照材料已成为近几年来的新型阳性材料研究的热点。目前，食品中的转基因成分检测已从定性提高到定量水平，由于传统定量PCR技术在到达扩增平台期时才开始定量检测，而不能消除每个靶基因扩增效率的差异产生的定量误差，导致传统定量PCR存在较大缺陷。理想条件下，每个循环PCR扩增的反应效率一致，PCR反应后DNA浓度与最初的目标DNA量是成正比。然而，扩增效率在不同的反应之间，或在同一反应的不同循环中在不断变化，特别是在PCR循环反应的后期，扩增产物以未知的反应速率呈非指数形式扩增。为使检测的灵敏度达到最高，常规PCR大多采用终点定量法，此时扩增产物量达到最大（即“平台期”）。但由于试剂的消耗以及聚合酶的逐渐失活，终产物的浓度和目标分子的初始浓度间的相互关系很难确定。近年来发展的实时荧光定量PCR技术是集PCR和探针杂交技术优点为一体，通过探测整个PCR过程中的荧光信号变化，准确定量DNA模板量，其检测灵敏度比常规PCR技术高100倍左右，可检测到每克样品中含2pg转基因DNA量，且对深加工产品和混合样品都可进行定量检测。相对于终点定量方法，实时荧光定量PCR反应体系可以随反应的实际进程实时监控整个反应变化。在实时荧光定量PCR中，PCR反应扩增产物的量和荧光信号的释放联系在一起，而且成一定比例，随着每个循环中PCR扩增产物量的增加，荧光信号也会成比例增加。记录每个循环中释放的荧光信号量，就可以监控整个指数期中PCR扩增反应的情况。
本文旨在研制几种常见的转基因作物的质粒标准分子并提供一套简便、准确、高效的转基因食品定量检测技术体系，以解决阳性标准品的缺乏和深加工制品检测繁琐、可信度差等技术难题。这为我国主要粮食作物转基因食品定量检测标准化提供技术平台，为建立完善的切实可行的深加工制品检测体系及GMO标签制度有效实施提供技术保证，同时为转基因食品标识、环境安全与使用安全的检测及长期跟踪监测、监控和安全隐患的预测、预警进而提供技术支撑。全文主要围绕定量PCR检测方法进行研究，参考我国最新国家标准、农业部公告、出入境检验检疫行业标准和欧盟标准等收集转基因材料，建立了5个主要物种13个品系的定量检测方法，其中转基因玉米(NK603、Bt11、59122、MON810、GA21、MIR604、MON863、TC1507、Bt176)品系9个，转基因大豆(GTS40-3-2)，转基因油菜(RT73)，转基因大米(TT51-1)，转基因甜菜(H7-1)品系各一个，这些物种涵盖了我国已批准和即将批准的主要进出口转基因植物。检测的靶序列包括内源基因和品系特异性序列共约20个常见基因序列。以标准样品作为初期研究对象，验证、优化这些基因的最佳反应条件和反应体系，在获得稳定、准确、高效的检测方法后，将之应用于转基因植物种子、饲料、食品等初加工和深加工食品的检测中。同时本文还构建了13个品系共9个新型质粒标准分子，并对其在实时荧光定量PCR检测体系中的灵敏度、稳定性和精确性等指标做了进一步分析，建立了13个转基因植物品系的定量PCR检测方法，采用Taqman探针法对这些物种的品系特异性序列进行定量分析并有效地应用到初加工和深加工等食品的转基因成分的检测中。
在质粒标准分子的研制中，本部分采用重叠延伸PCR成功构建了转基因大豆、玉米、油菜、大米、甜菜5个常见物种13个品系的质粒标准分子，该技术与传统的酶切连接方式不同，它不需要限制性内切酶和连接酶即可实现DNA片段的体外快速连接。有研究者指出为了最大限度地避免碱基的错配，重叠延伸PCR反应一般采用高保真DNA聚合酶，而本实验中采用了非保真的Taq聚合酶来完成重叠延伸PCR，这种酶没有3'→5'外切酶的活性，其扩增产物在3'端会自动添加碱基A，从本研究的实验结果可以看出非保真酶扩增结果也很稳定;同时，在实验过程中采用高保真与非保真酶的对比进行重叠延伸PCR实验，可以发现，连接片段在1000bp以内的这两种酶扩增效率几乎没有实质差别。此外，对于重叠延伸PCR所需引物的设计，本研究采用了两种设计方式:第一种方式是在内源基因反向引物和外源基因正向引物基础上添加与扩增引物无关的互补碱基序列，以这种方式获得的重组DNA包含了中间连接的“额外”片段。第二种方式是在内源基因反向引物和外源基因正向引物基础上添加与彼此互补的碱基序列，即添加在内源基因反向引物的接头序列为外源基因正向引物的互补序列，添加在外源基因正向引物的接头序列为内源基因反向引物的互补序列，以这种方式获得的重组DNA片段为两者扩增片段长度之和而不会出现“额外”片段。实验过程可发现第二种方式设计的引物重组DNA效果明显优于第一种方式。
我们构建的标准分子为重组的质粒分子，其包含一段或多段外源插入基因及品系特异性序列，以及该物种已经鉴定的内源基因的部分特异性片段。根据转基因生物检测策略，设计相应的标准分子构建方案。目前品系特异性检测方法因特异性最佳获得了越来越广泛的应用。本研究构建的质粒标准分子分别包含有内源基因及其品系特异性序列，其中pMD-1G、pMD-a5、pMD-FR、pMD-sT和pMD-GH五个质粒含有一个品系特异性序列和一个内源基因序列，pMD-aNB、pMD-aMB、pMD-aGM和pMD-aMT四个质粒含有两个品系特异性序列和一个内源基因序列。由于品系特异性序列是特异的外源插入载体与植物基因组的连接区序列，为单拷贝序列，比基因组DNA标准品中其它外源基因的拷贝数更精确，因此品系特异性检测方法具有很高的特异性和准确性，也更加适用于构建定量PCR检测所需的标准曲线。
在定量PCR检测方法的研究中，为更好地评价建立的实时荧光定量PCR检测体系的可行性，本研究对该检测体系的灵敏度、稳定性和精确性等指标做了进一步分析。选用20000copies/μl，2000copies/μl，200copies/μl，20copies/μl，2copies/μl五个浓度的标准溶液进行定量PCR的LOD和LOQ测定，得出其值分别为2copies和20copies;同时以转基因大豆为例，测试质粒标准分子pMD-1G的稳定性能，它们的SD和RSD均属正常范围，说明标准分子可稳定应用于定量PCR的检测中;理想条件下，质粒标准分子中的不同基因扩增效率保持一致，即外源基因和内源基因的扩增拷贝数之比为100％，但在实际检测中，其他因素常导致扩增效率不一致，本研究以1％质量分数的转基因大豆标准样品作为检测对象，计算得出Cf值的平均值为0.94，其SD和RSD分别是0.11和11.57％，据此可以推断pMD-1G质粒标准分子在定量PCR反应体系中的扩增几乎同步。又以已知5％、2％、1％、0.5％质量分数的标准样品测试标准分子用于定量检测的精确性，结果显示实际测得的转基因成分含量与真实值之间的差异随样品转基因成分含量增高而增加，5％和2％样品的检测偏差(bias％)小于5％，样品转基因成分含量较低时检测容易产生较大偏差。
在全面评估质粒标准分子各项指标后，采用Taqman探针法构建了这13个品系的标准曲线，每组样品的扩增效率（Eff％）在95.007％-118.438％正常范围内，线性相关系数(R2)≥0.990，同时每组样品的三次平行实验的重复性很高，这些证明了基于标准曲线用于定量检测转基因食品的可行性。此外，根据2692bp长的pMD-18T载体和13个品系基因组DNA的长度，我们将标准分子分别稀释成2000000copies/μl,200000copies/μl,20000copies/μl,2000copies/μl,200copies/μl，20copies/μl六个梯度的标准溶液，由此建立的标准曲线能准确定量出100ng0.1％-100％转基因样品基因组DNA，满足各个国家转基因标识制度(0.9％-5％)需要。在此基础上本研究对植物源性食品进行了定量分析，包括未加工、初加工和深加工共11种食品，其中最低定量值为1.27％，这些结果较好地说明了本研究能成功的应用于食品转基因成分定量检测。
转基因食品;标准分子;定量检测;品系特异性;Taqman探针
南方医科大学
硕士
生物化学与分子生物学
马文丽
2012
中文
TS207.3;Q503
105
2013-04-26（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）