血管内皮抑素(恩度)抑制角膜新生血管的实验研究
1、研究背景:
血管的形成和发生是一基本的生物学过程，在人体健康和疾病中有很多都与其密切相关。例如胚胎发生、正常生长和发育、创伤、修复、慢性炎症和许多肿瘤的转移，以及非肿瘤的血管源性疾病。新生血管形成在大约20多种眼部疾病中发挥着主要的作用。外周血液循环中的血管内皮细胞周围充满着血管促进因子和血管抑制因子。这些因子在正常情况下处于复杂而精细的平衡状态，使得局部的血管处于非增殖的静止状态。当某种刺激如缺血、缺氧或炎症等打破了这种平衡，就会导致新生血管疾病的产生。新生血管无论是生理性还是病理性，其进展顺序视乎相同，其形成过程大致分为5个阶段:
①第一阶段为母本血管内皮细胞的渗透性增加;
②第二阶段为母本血管基底膜和ECM崩解;
③第三阶段为穿过基底膜和ECM的内皮芽形成;
④第四阶段为内皮细胞移行和分裂;
⑤第五阶段为内皮细胞分支和管腔形成。
组织损伤和缺血最终会产生缺血、缺氧、组织坏死、炎症因子等反应，促进实质细胞和炎症细胞合成并释放VEGF、bFGF等促血管新生因子。
正常角膜透明无血管，是屈光间质的重要组成部分。角膜周围血管终止于角膜缘，形成血管网。角膜缘抗血管屏障功能的正常和抗新生血管生成因子的存在是维持角膜透明无血管的重要因素。当角膜受缺氧、炎症、外伤、手术、营养不良等多种刺激因素后，可以导致角膜促血管生成因子和抑制血管生成因子之间的平衡打破，促进了角膜新生血管的生成，产出角膜新生血管(corlleal neovascu—larization, CNV)，进而出现出血、渗出、角膜瘢痕化等改变，可影响角膜的透明性，最终可导致眼部组织结构的破坏和视功能的损害。在角膜移植的病例中，由于角膜新生血管的出现可以改变角膜的“相对免疫赦免(rela-tive immune privilege)”状态，进而产生角膜移植后的排斥反应，是角膜移植手术的失败的高危因素。CNV形成的机制复杂，对于CNV形成的机制，目前主要有两种理论学说，但其确切机制尚不完全清楚。第一种理论认为角膜基质的屏障功能受到破坏而形成CNV;第二种理论认为CNV主要是由于某些细胞血管生成因子过度表达引起。在众多致盲性眼病中，角膜混浊引起的失明占到我国盲人的第二位。是目前眼病致盲的最重要原因之一。除了CNV以外，眼部还有许多新生血管形成引起的疾病，可以导致视功能的严重障碍。从临床角度认识与眼部新生血管发生相关眼病如角膜炎、角膜溃疡等已经有几十年甚至上百年历史。目前临床用药治疗角膜新生血管暂无理想的药物。因此如何有效地抑制角膜新生血管的形成和生长，一直是角膜疾病研究的热点。
血管内皮抑素(endostatin，ES)，又称内皮细胞抑制素，它是迄今为止发现的最强的内源性血管生成抑制因子。该蛋白可以特异性抑制血管内皮细胞的生长，而对其他细胞无作用。它是细胞外基质胶原XⅦ羧基末端片段，含有184个氨基酸，分子质量20ku。最初是从鼠成血管细胞瘤株培养液中分离提纯得到的一种内源性糖蛋白，竞争性地抑制促血管形成因子而发挥作用。ES是一个多靶点的抑制血管生成因子，不仅能干扰VEGF的作用，而且抑制许多其他血管生成信号通路，比单靶点的的抗血管生成药物有着更大优势。动物实验证明，血管内皮抑制素蛋白能有效地抑制血管生成，抑制原位肿瘤及转移灶的的肿瘤生长。血管生成抑制剂不同于其他抗肿瘤药物，它靶向于基因功能稳定的血管内皮细胞，可抑制肿瘤的恶化和转移，故理论上此类药物不产生耐药性，是治疗肿瘤的理想药物。目前可以通过基因工程的方法在酵母菌合成重组人ES。重组人ES与鼠重组ES有高度的同源性，都含有4个保守的半膀胱氨酸，重组人ES作用与内皮细胞，无论bFGF或VEGF-165存在与否，内皮细胞的生长均受抑制，其迁移受影响，血管形态也受影响。重组人血管内皮抑制素类新生物制品是抑制新生血管作用最强、效果最好的药物之一。其作用机制是通过抑制形成血管的内皮细胞迁移而抑制肿瘤新生血管的生成，阻断肿瘤的营养供给，从而抑制肿瘤增殖或转移。
目前国内外有研究表明ES有抑制角膜新生血管的作用，大部分ES是从实验室提取得到，不同实验室提取得到的ES可能存在着个体差异。重组人血管内皮抑制素（Recombinant Human Endostatin Injection，商品名:恩度）是一种抗肿瘤新生血管生成的多靶点抑制血管生成因子的成品生物制剂，不仅能干扰VEGF的作用，而且抑制许多其他血管生成信号通路，比单靶点的的抗血管生成药物有着更大优势。自2005年在我国首次上市以来，在抗肿瘤新生血管的治疗上有确切的效果，实验研究陆续证明了它对65种不同类型肿瘤有明显的抑制作用。使用恩度做抑制新生血管的研究药物，其来源可靠，药物的差异性较小，可重复性强，比实验室提取内皮抑素更具有一定的来源优势。
国内研究重组人血管内皮抑素抑制缝线诱导的角膜新生血管对比研究尚未有报道。有研究血管内皮抑素抑制碱烧伤大鼠角膜新生血管动物模型。虽然碱化学烧灼法制备的动物角膜新生血管模型取材简单，可以诱导出角膜新生血管，但是存在有烧灼范围、烧灼深度等方面不易控制的问题。且化学药物对于抑制角膜新生血管药物是否有干扰仍存在不确定性。采用缝线诱导角膜新生血管法建立角膜新生血管动物模型，与碱烧伤诱导角膜新生血管方法动物模型比较，诱导的新生血管形成理想，且在形成时间、生长速度、生长方向等方面个体间差异小，角膜新生血管生长方向好，密度均匀，象限确定，长度较平均，易于比较。可以排除化学药物对防治药物的影响，对角膜影响小。
在目前所有的重组人血管内皮抑素抑制角膜新生血管的研究中均缺乏与临床使用抗角膜新生血管药物地塞米松的对比分析，对其确切的效果缺乏可比性。目前尚无重组人血管内皮抑素与临床治疗角膜新生血管药物地塞米松对比对于缝线诱导的兔角膜新生血管抑制作用的对比实验研究报道。
2、研究目的:
2.1、为抗肿瘤新生血管靶向药物在角膜新生血管的应用提供实验依据。
2.2、探讨在缝线诱导兔角膜新生血管形成的不同时间使用重组人血管内皮抑素（恩度）及地塞米松对角膜新生血管抑制的效果做对比分析。
3、材料和方法:
3.1、建立动物模型
新西兰大白兔24只，随机分3组（A组、B组和C组，每组8只），采用缝线诱导法制备兔角膜新生血管。
A组:生理盐水(NS)组:采用球结膜下注射0.9％氯化钠溶液0.1ml，隔日1次。
B组:重组人血管内皮抑素(ES)组:采用球结膜下注射重组人血管内皮抑制素0.1mL,隔日1次，C组:地塞米松组:采用球结膜下注射地塞米松0.1ml(0.5mg)，隔日1次。
每日裂隙灯下观察并测量角膜长出的角膜新生血管的长度，计算出新生血管的面积，共3周时间。
3.2、观察指标
从角膜缝线开始计算，分别在缝线后第4d、7d、13d、18d测量并记录从角巩膜缘长出的新生血管长度。使用计算机图像分析系统分析，计算各组角膜新生血管的生长面积。
3.3、统计学处理
采用SPSS13.0软件进行分析。计量资料以均数±标准差（(x)±S）表示，各组比较均用配对t检验。P＜0.05认为差异具有统计学意义。
4、结果:
各实验组角膜在缝线后第2天出现睫状充血，第3天可见角膜缘呈毛刷状新生血管向缝线处生长，第7天可达缝线处，第13天新生血管面积达高峰，后生长速度变慢。角膜新生血管生长情况:A组新生血管生长最旺盛，血管密集、粗大，B组和C组新生血管生长缓慢，血管细小、稀疏。B组、C组在角膜缝线后各时间点新生血管长度、面积均小A组，差异有统计学意义(P＜0.001)。B组较C组对角膜新生血管的抑制作用略强，在第13天和第18天两者之间的差异有统计学（P＜0.05）。
5、结论:
动物实验表明重组人血管内皮抑素（恩度）及地塞米松均可以有效的抑制缝线诱导角膜角膜新生血管的生长，在血管生成的早期有抑制作用，但抑制效果较差，在第13天、18天时抑制效果较好。重组人血管内皮抑素（恩度）对角膜新生血管抑制作用略强于地塞米松。
血管内皮抑素;角膜组织;临床疗效;新生血管;生长面积
南方医科大学
硕士
肿瘤学
罗荣城
2012
中文
R772.2;R965
53
2013-04-26（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）