重度子痫前期患者的血浆代谢组学研究
子痫前期(preeclampsia)伴有全身多脏器的损害，严重患者可因产后出血、脑出血、心功能衰竭、肺水肿、弥漫性血管内出血而死亡，引起胎儿宫内生长受限和早产。在世界范围内大约10％妊娠妇女血压升高，2％-8％妊娠妇女合并子痫前期，10％-15％孕产妇直接死亡原因和子痫前期、子痫有关。
关于子痫前期的发病机制存在很多学说却无统一定论。近年大量研究证据支持这样一个病因假说，即母体血管系统和早期胎盘不相容，免疫介导的滋养细胞侵蚀胎盘螺旋动脉，导致胎盘浅着床，血流灌注不足和缺氧，使得胎盘分泌一些毒性因子（如激素和代谢小分子）进入母体循环，从而活化血管内皮，导致血管内皮细胞功能的广泛改变和全身系统血管收缩，出现子痫前期临床症状。目前已知的与疾病发生相关的循环因子包括血管内皮生长因子、胎盘生长因子等，有学者对这些因子预测妊娠期高血压疾病发病的能力进行研究，遗憾的是这些已知的循环因子并不能很好的预测疾病的发生和发展。因此近年来人们希望通过组学技术寻找和发现循环中生物标记物，来预测疾病发生，判定疾病发展程度，尽早的给予合理预防和目标靶向治疗，这对于临床诊断和治疗子痫前期、降低孕产妇和围产儿死亡率具有重要意义。
代谢组学是组学技术的一种，可以概括为应用高通量、高分辨、高灵敏度的分析手段，定性定量研究生物体体液中的内源性代谢产物即代谢组，结合模式识别等化学信息学技术，分析生物体在不同状态下的代谢指纹图谱的差异，获得相应的生物标志物群，跟踪其代谢路径，从而揭示生物体在特定时间、环境下的整体功能状态。鉴于代谢组学技术可以获得生物标记物群，预测疾病发生，判定疾病发展程度，进行目标靶向治疗，英国学者利用基于气相色谱串联质谱的代谢组学技术研究子痫前期患者血浆代谢轮廓，分析代谢图谱的差异寻找代谢生物标记物群检测子痫前期，这个研究初步将代谢组学的研究方法应用于子痫前期，但是由于该实验选择气相色谱为分析分离手段，前期预处理过程较复杂，重复性低，花费时间较长，可能造成代谢产物丢失，且没有提供代谢生物标记物的结构信息，其生物标记物检测子痫前期的敏感性和特异性有待提高。
本课题选择基于液相色谱串联质谱为分析分离手段的代谢组学技术，结合化学信息学技术，检测重度子痫前期患者的血浆代谢轮廓，并进一步分析以氨基酸为目标的代谢指纹，寻找代谢生物标记群，希望找到一个有效的生物标记物，能够简单、快速的判定疾病发展的程度，在疾病发生早期即给予合理干预和靶向治疗，延缓疾病的发生发展，监测疾病的治疗效果，降低子痫前期的发生率，改善母儿预后。
第一章重度子痫前期患者的血浆代谢组学分析
[目的]
本研究采用基于HPLC/MS/MS-QTrap的代谢组学方法对重度子痫前期妇女和正常妊娠妇女血浆代谢组分进行检测、分析，旨在了解重度子痫前期的代谢轮廓，结合模式识别化学信息学技术，对比差异代谢产物，发现生物标记物群，尝试鉴定重度子痫前期的代谢生物标记物，在疾病发生早期即给予合理干预和靶向治疗，延缓疾病的发生发展，监测疾病的治疗效果，为进一步研究其发病机制开辟新思路。
[方法]
1、标本来源:选取2010年6月～11月在南方医科大学附属深圳市妇幼保健院产科住院分娩的重度予痫前期孕妇51例为重度子痫前期组。另选取同期定期产检，排除妊娠期合并症和并发症，单胎怀孕至足月，产后追踪胎儿无畸形的正常妊娠妇女45例（正常妊娠组）做为对照。研究对象入院后，立即抽取肘静脉血3ml置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管内。轻颠倒抗凝管5次，使用冷冻离心机，4℃以1500转离心15分钟，取血浆置于-80℃冰箱保存待测。
2、样品预处理:血浆室温解冻后，吸取100μl置离心管中，加入300μl甲醇沉淀蛋白，涡旋混匀1分钟，使用冷冻高速离心机，4℃离心15分钟，12000转。取上清液经针头式过滤器过滤后分析。
3、高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)分析:分别设置液相色谱、质谱条件及其工作模式，自动加样。
4、数据统计方法:原始的LC-MS数据文件，导入the MarkerViewTM软件进行数据的提取及前处理，采用主成分分析(PCA)观察各组样本间的总体分布状况。然后用主成分判别分析法(PCA-DA)鉴别对各组间代谢轮廓差异贡献较大的代谢物，找到与重度子痫前期最相关的差异代谢物。在MarkerViewTM软件包中对相关的差异代谢物行t检验。
[结果]
1、应用HPLC/MS/MS-QTrap进行检测，得到重度子痫前期组和正常妊娠组血浆的代谢物总离子流色谱(total ion chromatogram，TIC)对比图。重度子痫前期组和正常妊娠组的血浆代谢物总离子流色谱图有差别。
2、应用HPLC/MS/MS-QTrap进行分离和检测出九百多个代谢分子，得到代谢轮廓。51例重度子痫前期患者和45例正常妊娠妇女经代谢组学方法得到很好的区分，并找到相对应的16个潜在生物标记物，其中浓度呈下降趋势的代谢小分子有峰89、95、98、118、135、157、187、191、215、240，浓度呈上升趋势的有峰139、155、284、451、837、922。
[结论]
建立的基于HPLC/MS/MS-QTrap代谢组学方法可以区分重度子痫前期和正常妊娠，表明该方法适合于重度子痫前期的代谢组学研究。找到相对应的16个潜在的生物标记物，并对有差异的代谢物进行增强型全扫描(EMS)及增强性子离子扫描(EPI)，提供了大量代谢物结构上的信息，将来可以进一步鉴定代谢物名称并对其深入研究。综合代谢标记物变化趋势构成重度子痫前期的代谢特征，其对早期诊断重度子痫前期有很好的前景。
第二章重度子痫前期血浆氨基酸代谢轮廓分析
[目的]
本研究采用基于HPLC/MS/MS-QTrap的代谢组学方法分析重度子痫前期妇女和正常妊娠妇女氨基酸代谢指纹，建立基于HPLC/MS/MS-QTrap技术的血浆氨基酸代谢指纹方法。探讨重度子痫前期氨基酸代谢轮廓，为进一步研究氨基酸代谢在重度子痫前期发病代谢通路提供线索。
[方法]
1、标本来源:选取重度子痫前期妇女13例为重度子痫前期组，正常妊娠妇女10例做为对照。
2、样品预处理:待检血浆室温解冻后，吸取100μl置离心管中，加入300μl甲醇沉淀蛋白，涡旋混匀1分钟，使用冷冻高速离心机，在4℃以12000转离心15分钟。取上清液经针头式过滤器过滤，过滤后取50μl置于96孔过滤板中，每孔加入含氨基酸同位素内标的甲醇100μl，室温放置20分钟，萃取血片中的氨基酸，然后离心至另一个96孔聚丙烯板，50℃加热吹干，再加入60μl盐酸正丁醇(3mol/L)，Teflon膜覆盖，置65℃恒温箱内15分钟，随后50℃加热吹干，再加入80％乙腈100μl溶解，铝膜覆盖，即可上样检测。
3、高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)分析:分别设置液相色谱、质谱条件及其工作模式，自动加样。
4、数据统计方法:定量分析采用软件ChemoView1.2版本（美国生物应用系统公司），根据同位素内标和各种丁酯化的氨基酸离子峰强度，由已知浓度的内标，自动计算出所测样品中氨基酸的浓度。统计用SPSS13.0软件，得到浓度结果数据以(x)士S表示，经方差齐性检验后，若方差齐则采用两独立样本的t检验;若方差不齐则采用近似t检验，P＜0.05时有统计学意义。
[结果]
1、本实验应用HPLC/MS/MS-QTrap进行检测，成功得到重度子痫前期组和正常妊娠组血浆的氨基酸代谢指纹。
2、HPLC/MS/MS-QTrap定量分析重度子痫前期组和正常妊娠组血浆氨基酸代谢组，结果显示两组血浆氨基酸代谢组中苯丙氨酸、缬氨酸、精氨酸、鸟氨酸、脯氨酸差异有统计学意义（P值分别为0.004、0.030、0.035、0.010、0.028）。
[结论]
建立的基于HPLC/MS/MS-QTrap代谢组学方法可以得到血浆氨基酸代谢轮廓谱，表明该方法适用于研究重度子痫前期的氨基酸代谢指纹。找到相对应的5种氨基酸在重度子痫前期和正常妊娠妇女血浆代谢有差异，为生物标记物群预测重度子痫前期的发生提供线索。
全文小结：
1、建立的基于HPLC/MS/MS-QTrap代谢组学方法可以区分重度子痫前期和正常妊娠，表明该方法适合于重度子痫前期的代谢组学研究。
2、找到相对应的生物标记物群，对其进行增强型全扫描(EMS)及增强性子离子扫描(EPI)，提供了大量代谢物结构上的信息，将来可以进一步鉴定代谢物名称并对其深入研究。
3、代谢标记物群在重度子痫前期血浆浓度变化趋势构成重度子痫前期的代谢特征，对早期诊断重度子痫前期和疗效监测有很好的前景。
4、建立的基于HPLC/MS/MS-QTrap代谢组学方法可以得到血浆氨基酸代谢轮廓谱，表明该方法适用于研究重度子痫前期的氨基酸代谢指纹。
子痫;血浆代谢组学;发病机制;生物标记物;诊断价值;靶向治疗
南方医科大学
硕士
妇产科
王晨虹
2012
中文
R714.244;R363.27
63
2013-04-26（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）