环孢素降蛋白尿的非免疫机制研究——NFATc1介导的Upar--beta3整合素信号通路
研究背景:
肾小球的滤过屏障由毛细血管内皮细胞(endothelialcell)、肾小球基底膜(Glomerular basement memberane，GBM)以及足细胞(Podocyte)组成。当滤过屏障受损时，其通透性增加，进而血液中大量蛋白质通过屏障形成蛋白尿。蛋白尿是许多肾脏疾病的常见临床表现，同时也影响着肾脏疾病的预后[1]。在伴有大量蛋白尿的人类肾小球疾病和肾病动物模型中，都存在足细胞功能紊乱，足突融合消失是最主要和最常见的形态改变。因此近年来关于蛋白尿机制的研究多以足细胞为重点[2]。足突的肌动蛋白细胞骨架的重排可以导致足细胞足突的融合和滤过屏障的消失，进而产生蛋白尿[3]。
uPAR(尿激酶型纤溶酶原激活剂受体)是一种的磷脂酰肌醇(glycosylpho-sphatidylinositol)锚定糖蛋白，在损伤修复、炎症、肿瘤浸润和转移起着重要作用[4]。2008年WeiC等研究发现，在人类病变的肾小球、PAN肾病动物模型以及LPS诱导的蛋白尿动物/细胞模型中，uPAR表达增加，导致β3-integrin的激活，可导致足细胞活动增强并导致蛋白尿的产生[5]。2011年WeiC等该研究组还发现可溶性uPAR可能参与FSGS的发生[6]，由此可见，uPAR与蛋白尿关系密切。
环孢素是一种常用的免疫抑制药，能够很好地降低蛋白尿，治疗许多肾脏疾病[7]。一直以来人们认为其降蛋白尿的作用与其免疫抑制作用有关，作用机制是通过抑制Calcineurin(钙调磷酸酶)调节的活化T细胞核因子(NFAT)信号通路。但FAUL等[8]的研究表明环孢素是通过抑制Calcineurin导致的足细胞Synaptopodin的CatL蛋白酶解来降低蛋白尿，同时STEFANIDIS等研究表明环孢素在治疗由于WT1突变导致的肾病综合征中足细胞是一个作用靶点[9]。因此环孢素的降蛋白尿机制也与足细胞息息相关。
NFAT(活化T细胞核因子)首次在T细胞中作为一种与人IL-2启动子结合的核因子被发现。NFATc1是NFAT家族中的一员，各种刺激导致细胞内Ca2+募集时可以使NFATc1去磷酸后活化，由胞浆转位至核内，在细胞核内，它与一些细胞因子基因启动子中的顺式作用元件相结合[12]。NFATc1的活化受许多物质的调节[13]。NFAT家族在骨质疏松[14]、皮肤病如牛皮癣[15]以及心肌肥大[16]等方面都有重要作用，2010年Wang，Y.等研究表明，足细胞上NFATc1的活化可以导致蛋白尿的产生及肾小球硬化[17]。
结合我们研究组的第一部分试验结果:1.环孢素可以降低脂多糖诱导小鼠蛋白尿模型和5/6肾切除大鼠蛋白尿模型中的蛋白尿;2.在动物模型中，环孢素可以抑制beta3整合素(Itgb3)的活化;3在体外足细胞脂多糖(LPS)损伤模型中，环孢素可以抑制uPAR的表达及beta3整合素(Itgb3)的活化。但是环孢素为什么能够通过抑制uPAR降低蛋白尿的机制并不清楚，由于环孢素可以通过抑制Calcineurin降低蛋白尿，而且Calcineurin与NFATc1的活化关系密切，所以环孢素降低蛋白尿机制可能与NFATc1有关。本研究首先在脂多糖诱导小鼠蛋白尿模型和5/6肾切除大鼠蛋白尿模型上，观察环孢素对足细胞uPAR表达及beta3整合素(Itgb3)表达的影响;其次在体外足细胞上，运用脂多糖(LPS)足细胞损伤模型，通过设计并合成NFATc1siRNA，同时促进和抑制NFATc1活化，观察NFATc1对足细胞uPAR-beta3整合素信号通路的影响。初步探讨环孢素降蛋白尿足细胞相关的非免疫作用机制。
研究方法:
一、观察环孢素对LPS诱导小鼠短暂蛋白尿模型及5/6肾切除模型中足细胞uPAR表达及beta3整合素(Itgb3)表达的影响
动物模型已由我们研究组建立，肾脏组织已行冰冻切片于-80℃冰箱保存，使用免疫荧光借助激光共聚焦显微镜观察uPAR及beta3整合素(Itgb3)的表达。
二、足细胞培养、鉴定及实验分组
(一)足细胞培养:条件永生性小鼠足细胞由Baylor医学院Danesh教授惠赠。首先在5％CO2，33℃培养箱环境，用含20-100U·mL-1IFN-γ的RPMI1640和10％FBS放入(Ⅰ)型胶原包被的培养瓶中共孵育，使其获得增殖能力。然后转入5％CO2，37℃培养箱，用不含IFN-γ的DMEM加10％FBS共孵育，经10-14天的培养诱导，足细胞进入分化阶段并最终分化成熟。
(二)足细胞鉴定及形态学观察:分别对33℃含IFN-γ培养及37℃不含IFN-γ培养10-14天分化成熟后的足细胞在相差显微镜下直接拍片，观察其形态学差异;表达足细胞骨架蛋白synaptopodin的细胞为分化成熟的足细胞，未分化的足细胞不表达synaptopodin蛋白。
(三)按以下分组干预处理足细胞:
1)con组予等量DMSO干预24小时;
2)LPS组予50mg·L-1LPS干预24小时;
3)NFATc1-siRNA组予20nM、50nM、80nM等相应浓度NFATc1-siRNA干预48小时;
4)LPS+NFATc1siRNA(50nM)组予50mg·L-1LPS干预24小时+50nMNFATc1-siRNA干预48小时;
5)LPS+CsA(0.25)组予50mg·L-1LPS+0.25mg·L-1CsA干预24小时;
6)LPS+CsA(0.5)组予50mg·L-1LPS+0.5mg·L-1CsA干预24小时;
7)LPS+CsA(1)组予50mg·L-1LPS+1mg·L-1CsA干预24小时;
8)Ionomycin(500nM)组予500nMIonomycin干预1小时;
9)Ionomycin(1uM)组予1uMIonomycin干预1小时;
10)Ionomycin(2uM)组予2uMIonomycin干预1小时;
11)LPS+11R-VIVIT(10nM)组予50mg·L-1LPS和10nm11R-VIVIT共同干预24小时;
12)LPS+11R-VIVIT(100nM)组予50mg·L-1LPS和100nm11R-VIVIT干预24小时;
13)LPS+11R-VIVIT(1000nM)组予50mg·L-1LPS和1000nm11R-VIVIT干预24小时。
三、uPAR表达以及beta3整合素(Itgb3)表达与活化
分别用免疫荧光、流式细胞术及定量PCR检测uPAR表达及β3整合素合成、活化的变化。
四、足细胞活动力检测
刮除法(Woundhealingassay):在Ⅰ型胶原包被的六孔板爬片上培养细胞后，刮除细胞后给予不同的处理，通过免疫荧光观察不同处理组足细胞损伤修复的变化情况。
五、统计学处理计量资料数据以均数±标准差((x)±s)表示，应用SPSS13.0统计软件进行统计学分析，结果用单因素方差分析(One-wayANOVA)方法，方差齐性用LSD法进行组间多重比较，方差不齐用Dunnett'sT3法进行组间多重比较。P＜0.05被定为有统计学差异。
结果:
一、环孢素可以抑制LPS诱导小鼠短暂蛋白尿模型及5/6肾切除模型中足细胞uPAR表达而不影响beta3整合素(Itgb3)表达
(一)环孢素可以抑制LPS诱导小鼠短暂蛋白尿模型及5/6肾切除模型中足细胞uPAR表达:激光共聚焦显微镜观察，在LPS诱导小鼠短暂蛋白尿模型及5/6肾切除模型中，Con组及Sham组足细胞特异性骨架蛋白Synaptopodin主要表达于肾小球足细胞，uPAR广泛存在于肾小管和小球，二者很少在肾小球足细胞上融合;而LPS组及NTX组可见uPAR表达增加，荧光亮度较高，与足细胞特异性骨架蛋白Synaptopodin在肾小球足细胞上广泛融合;在LPS+CsA组及NTX+CsA组明显可见uPAR表达下调，荧光亮度降低，足细胞特异性骨架蛋白Synaptopodin在肾小球足细胞上融合减少。
(二)环孢素不影响LPS诱导小鼠短暂蛋白尿模型及5/6肾切除模型中足细胞beta3整合素(Itgb3)表达:激光共聚焦显微镜观察，在LPS诱导小鼠短暂蛋白尿模型及5/6肾切除模型中，Con组及Sham组足细胞特异性骨架蛋白Synaptopodin主要表达于肾小球足细胞，beta3整合素(Itgb3)广泛存在于肾小管和小球，二者在肾小球足细胞上广泛融合;LPS组及NTX组、LPS+CsA组及NTX+CsA组beta3整合素(Itgb3)表达较Con组及Sham组无明显变化。
二、足细胞形态学观察及鉴定结果
足细胞在33℃含IFN-γ培养基下培养，呈鹅卵石样或树枝样交错排列，为增殖状态的足细胞;在37℃无IFN-γ条件下培养10-14天后，足细胞分化成熟，胞体变大，胞质变淡，呈云朵状，分出许多初级及次级足突相互交错，为分化状态的足细胞;33℃IFN-γ培养条件下足细胞处于增殖状态，不表达足细胞特异性骨架蛋白synaptopodin;而37℃无IFN-γ条件下培养10天分化成熟后的足细胞表达足细胞特异性骨架蛋白synaptopodin，可见细胞内拉丝状细胞骨架。
三、环孢素抑制体外培养足细胞uPAR的表达，而不影响beta3整合素(Itgb3)的表达
(一)环孢素抑制体外培养足细胞uPAR的表达:免疫荧光检测，脂多糖组uPAR蛋白荧光信号明显强于正常对照组和脂多糖+环孢素组，正常对照组与脂多糖+环孢素组荧光信号无明显差异。流式细胞术检测，LPS组uPAR蛋白表达率明显高于正常对照组(P=0.002)有统计学差异，给予CsA后uPAR蛋白表达率较LPS组明显降低，LPS+CsA(0.5)组(P=0.002)及LPS+CsA(1)组(P=0.002)，有统计学差异。
(二)环孢素不影响beta3整合素(Itgb3)的表达:流式细胞术检测，con组、LPS组、LPS+CsA(0.25)组、LPS+CsA(0.5)组及LPS+CsA(1)组各处理组间beta3整合素(Itgb3)蛋白表达率总体均数比较差别不大(F=0.548,P=0.703)。
四、NFATc1siRNA转染后可以抑制LPS诱导的足细胞uPAR的表达及beta3整合素(Itgb3)的活化，但不影响beta3整合素(Itgb3)的合成
(一)NFATc1siRNA转染后可以抑制LPS诱导的足细胞uPAR的表达:实时定量PCR检测足细胞uPARmRNA表达，与con组相比，LPS组uPARmRNA表达明显上调，有统计学差异(P=0.000);与LPS组相比，LPS+NFATc1-siRNA(50nM)组uPARmRNA表达明显下调，有统计学差异(P=0.000);流式细胞术检测uPAR蛋白表达率，与con组相比，LPS组uPAR蛋白表达率明显上调，有统计学差异(P=0.019);与LPS组相比，LPS+NFATc1-siRNA(50nM)组uPAR蛋白表达率明显下调，有统计学差异(P=0.045)。
(二)NFATc1siRNA转染后可以抑制LPS诱导的足细胞beta3整合素(Itgb3)的活化，但不影响beta3整合素(Itgb3)的合成:实时定量PCR检测con组、controlsiRNA(50nM)组、NFATc1-siRNA(50nM)组、LPS组、LPS+controlsiRNA(50nM)组及LPS+NFATc1-siRNA(50nM)组)足细胞Itgb3mRNA表达总体均数比较差别不大(F=0.116，P=0.971);流式细胞术检测con组、controlsiRNA(50nM)组、NFATc1-siRNA(50nM)组、LPS组、LPS+controlsiRNA(50nM)组及LPS+NFATc1-siRNA(50nM)组beta3整合素蛋白表达率总体均数比较差别不大(F=0.736,P=0.611);流式细胞术检测活化beta3整合素表达率与con组相比，LPS组活化beta3整合素表达明显上调，有统计学差异(P=0.000);与LPS组相比，LPS+NFATc1-siRNA(50nM)组活化beta3整合素表达明显下调，有统计学差异(P=0.000)。
五、Ionomycin(NFATc1活化剂)干预后上调足细胞uPAR的表达及beta3整合素(Itgb3)的活化，但不影响beta3整合素(Itgb3)的合成
(一)Ionomycin(NFATc1活化剂)干预后上调足细胞uPAR的表达:实时定量PCR检测足细胞uPARmRNA表达，与con组相比，Ionomycin(2uM)组uPARmRNA表达明显上调，有统计学差异(P=0.010);流式细胞术检测足细胞uPAR蛋白表达率，与con组相比，Ionomycin(500nM)组、Ionomycin(1uM)组及Ionomycin(2uM)组uPAR蛋白表达率均明显上调，有统计学差异(P=0.000，P=0.000，P=0.000)。
(二)Ionomycin(NFATc1活化剂)干预后上调beta3整合素(Itgb3)的活化，但不影响beta3整合素(Itgb3)的合成:实时定量PCR检测足细胞Itgb3mRNA表达，各处理组之间Itgb3mRNA表达总体均数比较差别不大(F=0.308,P=0.757);流式细胞术检测beta3整合素蛋白表达率，各处理组之间beta3整合素蛋白表达总体均数比较差别不大(F=0.699,P=0.579);流式细胞术检测活化beta3整合素表达率，与con组相比，Ionomycin(500nM)组、Ionomycin(1uM)组及Ionomycin(2uM)组活化beta3整合素表达均明显上调，有统计学差异(P=0.024，P=0.000，P=0.000)。
六、11R-VIVIT(NFATc1抑制剂)干预后可以抑制LPS诱导的足细胞uPAR的表达及beta3整合素(Itgb3)的活化，但不影响beta3整合素(Itgb3)的合成
(一)11R-VIVIT干预后可以抑制LPS诱导的足细胞uPAR的表达:实时定量PCR检测足细胞uPARmRNA表达，与con组相比，LPS组uPARmRNA表达明显上调，有统计学差异;与LPS组相比，LPS+11R-VIVIT(100nM)组及LPS+11R-VIVIT(1000nM)组uPARmRNA表达明显下调，有统计学差异(P=0.018，P=0.002);流式细胞术检测足细胞uPAR蛋白表达率，与con组相比，LPS组uPAR蛋白表达率明显上调，有统计学差异(P=0.000);与LPS组相比，LPS+11R-VIVIT(100nM)组及LPS+11R-VIVIT(1000nM)组uPAR蛋白表达率明显下调，有统计学差异(P=0.000，P=0.000)。
(二)11R-VIVIT干预后可以抑制LPS诱导的足细胞beta3整合素(Itgb3)的活化，但不影响beta3整合素(Itgb3)的合成:实时定量PCR检测con组、LPS组、LPS+11R-VIVIT(10nM)组、LPS+11R-VIVIT(100nM)组、LPS+11R-VIVIT(1000nM)组足细胞Itgb3mRNA表达总体均数比较差别不大(F=0.149,P=0.959);流式细胞术检测con组、LPS组、LPS+11R-VIVIT(10nM)组、LPS+11R-VIVIT(100nM)组、LPS+11R-VIVIT(1000nM)组足细胞beta3整合素蛋白表达总体均数比较差别不大(F=0.465,P=0.760);流式细胞术检测足细胞活化beta3整合素表达率，与con组相比，LPS组活化beta3整合素表达率明显上调，有统计学差异(P=0.01);与LPS组相比，LPS+11R-VIVIT(100nM)组及LPS+11R-VIVIT(1000nM)组活化beta3整合素表达率明显下调，有统计学差异(P=0.005,P=0.011)。
七、刮除法检测足细胞活动力改变
LPS组及Ionomycin(1uM)组刮除后的足细胞细胞损伤修复比Con组明显增加(均P=0.000)，有统计学意义;LPS+siRNA(50nM)组、LPS+11R-VIVIT(100nM)组及LPS+CsA(0.5mg·L-1)组刮除后的足细胞细胞损伤修复比LPS组显著降低(均P=0.000)，有统计学意义。
结论:
1、在体内动物模型及体外细胞模型上，环孢素可以抑制足细胞uPAR的表达及beta3整合素的活化，而不影响beta3整合素的合成。
2、环孢素可能通过NFATc1介导调节uPAR-beta3整合素信号通路，进而保护足细胞，降低蛋白尿。
足细胞;环孢素;尿激酶型纤溶酶原激活剂受体;beta3整合素;活化T;细胞核因子;信号通路
南方医科大学
硕士
肾脏病学
史伟
2012
中文
R692.6;R361.3
89
2013-04-26（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）