BMP-7在雷奈酸锶促进骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的作用
[研究背景和目的]:
骨质疏松(Osteoporosis)主要是由于骨吸收与骨形成之间的平衡被打破，骨吸收量大于骨形成量，从而引起骨量减少的一种疾病。一般认为，破骨细胞活性增强，导致骨吸收增加，是形成骨质疏松的重要原因。
骨髓间充质干细胞(Bonemarrowstromalstemcells，BMSCs)在特定的诱导条件下，可以向不同的细胞方向分化，包括成骨细胞、神经细胞、心肌细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。鉴于BMSCs具有定向成骨分化的潜能，骨髓间充质干细胞也成为人工骨材料的主要来源之一。BMSCs的研究也逐渐引起人们的关注。
BMSCs成骨转化过程中有多种成骨标志物，其中碱性磷酸酶(ALP)活性的提高是成骨分化的重要标志之一，另外ALP也参与成骨细胞的结节钙化。骨形态蛋白（Bonemorphogeneticprotein，BMP）是多功能生长因子，属于转化生长因子-β(TGF-β)超家族，是一组具有类似结构的保守的功能蛋白组成，能够在体内诱导骨和软骨形成，并在肢体生长、软骨内骨化、骨折早期软骨修复及骨骼的胚胎发育和再生修复等方面起重要作用。已知的已经被克隆出的BMPcDNA有17种，目前的研究表明能有效地促进BMSCs向成骨细胞分化，诱导骨的形成的BMP主要是BMP2/3/4/5/7。BMP-7是骨形态发生蛋白家族中的一员，主要在骨组织和肾组织中表达，特别在骨发育和骨折愈合过程中高表达。研究发现BMP-7在自体骨表面可以生成关节软骨面，还可以在某些特定的环境下修复软骨、肌腱和韧带。国内外研究表明给予外源性BMP-7可促进BMSCs向成骨转化。国外研究表明应用BMP-7治疗骨损伤的治愈率明显高于对照组。因此BMP-7作为促进骨形成的重要骨形成蛋白因子，引起越来越多人的关注。
Osterix(OSX)是最新由Nakashima等人发现的一种含锌指结构的转录因子，属于Sp/XKLF家族，它是一个由428个氨基酸组成的蛋白质，研究表明OSX蛋白分布于细胞核中，其作用与组织的分化成熟密切相关。在OSX基因剔除的小鼠胚胎中，膜性骨骼的致密间充质和软骨内骨骼的骨膜及间充质中，成骨细胞分化的各种标志物的表达水平严重降低或者缺如，可见成骨细胞的分化被完全阻断。OSX基因剔除细胞可表达软骨细胞的特征性标志物，因此OSX可能具有抑制骨/软骨祖细胞向软骨细胞分化的功能。
雷奈酸锶(Strontiumranelate，Sr)是新型的抗骨质疏松药物，具有促进骨形成，抑制骨吸收的作用，它能保护去卵巢大鼠的骨流失，并且可促进成骨细胞ALP活性的表达。给予Sr治疗能明显促进成骨细胞转录因子水平的增高。此外越来越多的研究者关注分子水平上Sr促进骨形成的机制。本实验通过观察BMSCs成骨细胞转化过程中ALP、BMP-7、钙结节、OSX基因表达，探讨Sr促进骨形成的作用。通过添加BMP-7阻断剂noggin观察Sr促进骨形成过程中ALP、BMP-7、钙结节、OSX基因表达的变化，探讨Sr促进BMSCs向成骨细胞转化过程BMP-7所起作用，为临床上应用Sr防治骨质疏松等疾病提供新颖的实验依据。
[实验方法]:
1、SD大鼠骨髓间充质干细胞培养
本实验拟采用步骤相对简单的全骨髓贴壁法将BMSCs从骨髓中分离出来，并在体外进行培养和扩增，倒置显微镜下观察其增殖和生长特性。以此建立一套稳定有效、重复性好的BMSCs体外分离、培养和扩增的方法。并取生长良好的第3～4代BMSCs用做实验。
2、分别用细胞碱性磷酸酶标法、茜素红染色法、免疫印迹法(Westernblotting)、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测不同浓度Sr作用下ALP活性的表达、钙结节的表达、BMP-7的表达水平及特异转录因子OSX基因的表达情况;相同浓度Sr作用不同时间作用下BMP-7及OSX基因的表达情况。
3、加入BMP-7阻断剂noggin预处理BMSCs2小时后再加入Sr处理培养细胞并用碱性磷酸酶标法、茜素红染色法、Westernblotting方法、RT-PCR方法检测对照组及各实验组的ALP活性、钙结节的表达、BMP-7及OSX基因的表达情况。
4、统计学方法:计量资料数据以均数(x)±S表示，应用SPSS17.0统计软件进行统计学分析，结果可采用两独立样本T检验和单因素方差分析(One-wayANOVA)方法，方差齐性用LSD法进行组间多重比较，方差不齐时用Dunnet-t检验。P＜0.05被定为有统计学差异。
[实验结果]:
1.细胞学形态观察
细胞接种后随即在倒置显微镜下观察，培养液中存在着很多大小不等的圆形细胞，其中造血细胞为主要成分。原代BMSCs接种24小时，仅见少量贴壁细胞，近似圆形或短梭形，48小时贴壁细胞逐渐增多，细胞渐变长。3天后更换培养液，除去绝大部分悬浮细胞，可见分散的BMSCs小集落，集落细胞呈放射状生长。随培养时间延长细胞集落增大，细胞形态为长梭形，9～10天细胞集落彼此融合，呈旋涡状生长。
2.不同浓度Sr对BMSCs成骨分化过程中ALP活性的影响
BMSC分别给予Sr浓度为0.1、1、3、5和7mmol/L，诱导分化细胞连续培养7天后检测ALP活性，发现ALP活性增强，其中在0.1-3mmol/L浓度范围内，Sr呈浓度依赖性地增加ALP活性。浓度为3mmol/L是ALP活性表达最高。
3.Sr促进BMSCs向成骨细胞转化过程中钙结节表达
实验组BMSCs加入浓度为3mmol/LSr，对照组BMSCs不加Sr，共同培养21d后，行茜素红染色。结果显示，实验组钙结节表达高于对照组，表明Sr明显促进BMSCs向成骨细胞转化。
4.Sr对BMP-7表达的影响
0.1-5mmol/LSr在促进BMSCs向成骨细胞转化过程中可上调BMP-7的表达，在0.1-3mmol/L浓度范围并呈浓度依赖性地促进BMP-7的表达，其中浓度为3mmol/L时BMP-7表达最多，浓度为5mmol/L时促进作用下降，但与对照组相比，差异仍具有统计学意义(P＜0.001)。相同浓度Sr作用下，在1-7天范围内可呈现时间依赖性地促进BMP-7的表达。与对照组相比，作用第7天时，BMP-7表达最多，差异有统计学意义(P＜0.001)。Sr作用10天与第7天相比BMP-7表达虽减少，但与对照组相比，差异仍有统计学意义(P＜0.001)。
5.Sr对OSX表达的影响
Sr浓度在3mmol/L以内可上调OSX基因的表达，其中浓度为1mmol/L时OSX表达最多，当Sr浓度为5mmol/L时，对OSX基因的表达成抑制作用，与对照组相比，差异具有统计学意义(P＜0.001)。1mmol/LSr处理BMSCs不同时间（30分钟-14天）后呈现时间依赖性地促进OSX基因的表达。与对照组相比，其中Sr处理7天时，OSX基因表达最多，差异有统计学意义(P0.001)，Sr作用14天与第7天相比OSX基因表达虽有减少，但与对照组相比，差异仍有统计学意义(P＜0.001)。
6.BMP-7阻断剂noggin对抗Sr诱导的BMSCs成骨分化过程中BMP-7表达
浓度为3mmol/LSr作用BMSCs7天可促进BMP-7表达，差异具有统计学意义(P＜0.001)，在Sr处理BMSCs2小时前，应用100ng/mlnoggin预处理细胞可使BMP-7表达减少，与Sr组相比差异有统计学意义(P0.001)。
7.BMP-7阻断剂noggin对抗Sr诱导的BMSCs成骨分化过程中ALP活性表达
与对照组相比Sr组ALP活性增高，差异具有统计学意义(P＜0.001);在Sr处理BMSCs前2小时，应用100ng/mlnoggin处理细胞可使ALP活性较Sr组减少，差异有统计学意义(P＜0.001);noggin及PBS本身与对照组相比ALP活性无影响，差异无统计学意义(P＞0.05)。
8.BMP-7阻断剂noggin对抗Sr诱导的BMSCs成骨分化过程中钙结节表达
与对照组相比Sr(3mmol/L处理21天)组钙结节表达增多，在Sr处理BMSCs前2小时，应用100ng/mlnoggin可使钙结节较Sr组减少，noggin及PBS本身对钙结节表达无明显作用。
9.BMP-7阻断剂noggin对抗Sr诱导的BMSCs成骨分化过程中OSX基因表达
1mmol/LSr作用BMSCs7天明显地促进OSX基因表达，差异具有统计学意义(P0.001)，在Sr处理BMSCs2小时前，应用100ng/mlnoggin预处理细胞可使OSX基因表达减少，与Sr组相比差异有统计学意义(P0.001)。
[结论]:
本实验证实在BMSCs向成骨转化过程中，Sr能促进各成骨标志物的表达如:ALP活性、钙结节、成骨基因(OSX)等，进一步证实雷奈酸锶可促进BMSCs向成骨细胞转化。Sr促进BMSCs向成骨细胞转化能浓度及时间依赖性地使BMP-7蛋白及OSX基因表达明显增加。为探讨Sr在促进BMSCs向成骨细胞分化过程中与BMP-7表达的关系。本实验在Sr作用BMSCs前加用BMP-7阻断剂noggin，实验结果表明，noggin可明显地阻断Sr对BMP-7表达的上调作用，并使ALP活性、钙结节形成减少，BMP-7及OSX基因的表达降低，因此我们推断Sr促进BMSCs向成骨转化可通过BMP通路，并与BMP-7的表达有相关性。
雷奈酸锶;骨髓间充质干细胞;成骨分化;骨形成蛋白-7;碱性磷酸酶
南方医科大学
硕士
内分泌与代谢
吴文
2012
中文
R681.1;R977
69
2013-04-26（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）