高分辨率熔解曲线分析检测大肠肿瘤粪便DNA突变性能评价
研究背景和目的：
全球结直肠癌(CRC)发病率位于恶性肿瘤的第3位，我国位于第4～6位，呈逐年上升的趋势。广东省CRC发病率的上升速度较快。CRC的预后与早期诊断密切相关。绝大多数CRC是由“正常-腺瘤-癌”逐步演变而来，从可辨认的腺瘤发展为侵袭性癌约需5-10年，这为预防及早期筛查提供了充裕的时间。大量研究已证实发生癌变的腺瘤主要为晚期腺瘤(AA，指直径≥1cm或组织学证实为绒毛状腺瘤或重度异型性增生的腺瘤)，通过临床筛查并及时切除癌前病变如腺瘤，可降低CRC发病率及病死率。
结肠镜检查因准确性高且能治疗而被首选，但存在需要专业的内镜医生、风险较大、费用高、患者接受性差等不足，难以大规模应用于无症状人群的筛查;粪便隐血试验(FOBT)具有简便、无创、经济，接受性好等优点而被优选，但存在假阳性率及假阴性率较高、需要多次送检等不足，由于腺瘤检出率敏感度低，因而对癌症发病率的影响小;粪便DNA检测具有只需一次送检、易接受、依从性高、不需服药或控制饮食、不受肿瘤部位影响等优点而被重视。大量研究表明粪便DNA检测的敏感性和特异性比FOBT好，尤其腺瘤检出率高引人注目。已列为美国指南候选方法。
但现有的粪便DNA检测方案尚需完善，主要是敏感性与特异性有待提高，费用需降低、操作需简单化等。除了尚需进一步优化/更替现有的标志物组合外，升级现有的检测方法也是关键环节。现有的高敏感性和特异性的粪便DNA检测方法，普遍存在费用高、操作复杂、过于专业化、受制于待检目标基因位点的等问题。因此寻求一种便捷易用、经济高效的检测方法是提升粪便DNA检测实用价值的必要条件。
高分辨率熔解曲线分析(HRMA)是犹他州大学Wittwer实验室与美国Idaho公司联合研制的一种PCR后闭管操作技术:通过高密度荧光数据采集，直接用熔解曲线检测PCR扩增片段中微小序列差别。具有低成本、高通量、无污染、快捷、操作简单、不受变异位置影响、敏感性及特异性好等优势。自2003年被引入检测基因突变以来，HRMA的应用与发展如“雨后春笋”，在医学分子诊断中越来越受到关注。经荟萃分析发现其灵敏度达97.5％(95％置信区间(CI)，96.8-98.5)、特异度达95.8％(95％CI:95.3-96.3)，DNA样本的来源及饱合染料类型均对HRMA的灵敏度无影响。我们前期的研究已经初步展示HRMA用于粪便DNA突变检测，获得较高的检出率，具有潜在临床应用价值。目前国内尚无有关评价HRMA方法用于粪便DNA检测筛查CRC的文献报道。
因此，本研究在前期研究基础上，以DNA测序结果作为金标准，扩大样本量、更新试验设计方案、优化实验条件及操作流程等方式对HRMA的准确性展开较为全面的评价性研究。首先在组织样本中建立与优化HRMA操作流程与实验参数;然后，在2个独立的样本集(包括“学习集”与“验证集”阶段)中对HRMA应用于粪便DNAKRAS与TP53突变的检测的敏感性和特异性进行全面评价;同时，在DNA系列稀释试验中评估HRMA技术的敏感性:最后，探讨检出的粪便KRAS、TP53突变与大肠肿瘤性病变的临床病理特征参数的关系及诊断价值。
方法：
研究对象:2010.1-2010.7间在惠州市中心医院及南方医院接受肠镜检查者和/或普外科住院的术前CRC与AA患者中，及肠镜检查未发现明显异常的病人中。按下列纳入与排除标准，连续收集这些患者的粪便标本与临床病理特征参数资料，在“学习集”部分收集相应的肿瘤的FFPE组织标本。
研究组纳入标准:(1)年龄大于40岁、且病理组织学检查确诊为结直肠AA与CRC患者;(2)能同时收集病变组织与合格粪便样本(重量不低于5克)的患者。
研究组排除标准:(1)家族性或遗传性结直肠腺瘤或肿瘤;其他系统或器官肿瘤。(2)共患有炎症性肠病;(3)术前有放疗或化疗史;(4)妊娠或有严重肝肾功能不全者;(5)非原发癌灶者及不能确诊等其他情况;(6)既往有CRC或腺瘤病史;(7)肉眼见全血性大便者。
粪便样本采集:在内镜检查或肿瘤切除手术前、接受任何形式的结直肠侵入性操作或服用泻剂肠道准备的1周后，收集至少5克新鲜粪便量于48小时内尽快冻存于-80℃冰箱待用。
DNA提取与质控:按QIAamp粪便DNA、FFPEDNA的提取试剂盒的说明书方法提取DNA，在FFPE组织取样时，采用传统手工微切的方法，保留每一块样本中含有肿瘤细胞占的比例≥50％。提取DNA的浓度和纯度测定均用NanoDropND-1000分光光度计检测，达标要求:浓度≥50ng/μL，260/280nm的吸光度位于1.6-2.2且230/260nm位于2.0-2.5。达标的样本DNA均稀释到50ng/μL的终浓度，置入-20℃冰箱保存待用。
HRMA检测:基于NCBI的TP53外显子5-8、KRAS2-3的参考基因序列设计引物，KRASExon2(92bp)f-TTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAA，r-TGAAT-TAGCTGTATCGTCAAGGCACT;Exon2(155bp)f-TTATAAGGCCTGCTGAAAAT-GACTGAA,r-TGAATTAGCTGTATCGTCAAGGCACT,Exon3f-GACTGTGTTTCT-CCCTTCTC,r-TGTACTGGTCCCTCATTGC;TP53Exon5f-GTGCAGCTGTGGGTT-GATT;r-AACCAGCCCTGTCGTCTCT,Exon6f-GATTCCTCACTGATTGCTCTTA-Gr-GGGCACCACCACACTATG;Exon7f-TTGGGCCTGTGTTATCTCCTr-TGGCAAGTGGCTCCTGAC,Exon8f-TTGCTTCTCTTTTCCTATCCTGAr-GCTTCTTGTCCTGCTTGCTT。其中，KRAS基因外显子2，设计2对引物，扩增的片段分别为92bp和155bp。KRAS基因外显子2(155bp)的检测是在LightCycler480PCR仪上操作;其他的KRAS基因外显子2(92bp)-3，TP53基因外显子5-8基因均在Rotor-GeneTM6000PCR仪上操作。反应体系:2μL(100ng)样本DNA，上下引物各为1μL(200nmol/L)，镁离子2μL(2.5mmol/L)，LightCycler480HRMMaster/qPCRMaster预混液12.5μL，加ddH2O至总体积25μL。反应条件参数:95℃预热5分钟，95℃×15秒→60℃-63℃×50秒→72℃×30秒→72℃×10分钟，共50个循环。PCR产物在95℃变性5分钟，冷却至40℃×1分钟(让异源双链形成)然后在65℃升至95℃间，荧光采集密度为25次/℃。HRMA分析:原始采集的荧光曲线经过正常化和温度调整处理后，野生型基因被用来作为阴性对照。曲线图形的差异表示扩增的样本基因序列存在变异。HRMA突变阳性样本记为异常熔解曲线。采集的数据经罗氏公司的基因分析软件(1.5版)及RotorGene的软件(V1.7.25版)分析得出结果。
DNA测序检测:首先，对PCR产物进行酶切纯化:1、将每个样本PCR产物使用1％的琼脂糖凝胶进行检测，确认目的条带是否单一;2、经上述琼脂糖凝胶检测条带单一的，使用SAP(虾碱性磷酸酶)和ExoI(外切核酸酶)进行酶切纯化;3、经上述琼脂糖凝胶检测有非特异性的条带，使用BioMIGA的琼脂糖凝胶回收试剂盒进行割胶回收。接着，在用在ABI3730DNA测序仪上进行单向测序，采用的是Sanger法。最后，使用3730XL软件、DNAMAN软件对测序数据进行分析，得出最终结果。所有样本DNA的测序均送上海硕士生物有限公司检测分析。
统计方法
以α=0.05为检验水准，各组间年龄，两样本t检验;所有的计数资料的比较，多样本间采用x2检验，四格表采用Fisher确切概率法，若配对资料采用McNemar检验，符合率采用Kappa分析。统计分析均使用SPSS13.0软件包及EpiCalc2000统计软件。
结果：
参与患者的临床病理特征参数
最初，有145例大肠肿瘤性病变患者，70例结肠镜检查阴性的病人(NC)作对照组。28例因粪便样本不符合纳入与排除标准而剔除。接下来，187提取DNA，12例因DNA质量不达标而排除。最终纳入研究共175例，63例CRC，52例AA，60例年龄相匹配的NC，所有参与者均是中国人。患者病情诊断的确定均是根据结肠镜检查结果和/或完整切除肿瘤的标本病理诊断。CRC组的平均年龄为61岁(41-87岁)，AA组的平均年龄为58岁(40-80岁)，对照组平均年龄为47岁(40-73岁);病例组男女性比例69/57，其中CRC为32/31，AA为37/26，而对照组为24/36;CRC、AA原发部位位于近端结直肠分别为88.9％(56/63)、86.5％(45/52);Duck's分期中，A+B期占60.3％;病例组KRAS外显子2-3突变率为26.1％(30/115)，TP53外显子5-8突变率为21.7％(25/115)，对照组突变率3.3％(2/60)。
“学习集”阶段研究
为了建立及优化HRMA技术的实验条件与参数设定。我们在CRC与AA的组织样本中，对HRMA检测突变基因的准确性进行评价。先对合格的40例病人的FFPE的样本进行测序证实KRAS外显子2-3与TP53外显子5-8基因突变情况，再用HRMA检测其基因突变的情况，我们检出22例病人有基因突变，其中17例来自29例CRC，5个来自AA，突变检出率55％(22/40)。两者检测结果完全一致，其敏感度与特异度均为100％。随后基于上述优化的HRMA的技术操作流程，我们就对其相应的粪便DNA的突变进行检测，结果发现，HRMA检出18例(18/40，45％)突变，其中，CRC14例(14/29，48.28％)，AA4例(4/11，36.36％)，这些检测结果均被随后的测序所证实，HRMA的敏感度与特异度均为100％。粪便DNA与相应组织的突变检出率的符合率高度一致，18/22(81.82％)，其中CRC14/17(82.35％)，AA4/5(80％)，Kappa值为0.794，在CRC、AA中分别为0.794、0.814。
HRMA的敏感性分析
为了评价HRMA在结直肠癌筛查的环境中检测粪便DNA突变的可靠性，我们采用DNA的系列浓度稀释试验评估HRMA检测最低水平基因突变的灵敏度。选用已知KRAS基因外显子2及TP53基因外显子6-8突变具体情况的粪便样品DNA系列稀释实验，选用同样的粪便DNA中的野生型样本作为稀释实验的背景。我们发现，HRMA检出突变基因的最低稀释浓度限度为1％，但样本间存在的差异大;HRMA能够稳定可靠的检出浓度为≥5％。
“验证集”阶段研究
基于前二个部分研究得出的HRMA具有与测序一致的敏感性与特异性，且检出突变基因的最低浓度限度能达1％。促使我们在“验证集”中进一步评价其准确性。75例病例组，包括34例CRC和41例AA，60例对照组。在病例组的粪便DNA中，共检出含有KRAS和/或TP53基因突变频率为(49.3％，37/75)，显著高于对照组(3.3％，2/60)(P＜0.001);在病例组的亚组分析中，基因突变率在CRC亚组(58.8％，20/34)与AA亚组(41.5％，17/41)之间的存在显着性差异(P=0.02)。HRMA检测的结果，均被随后的测序证实，其敏感度与特异度均为100％。
粪便基因突变与临床病理特征参数关系及临床诊断价值
1、病例组中，CRC、AA原发于近端结直肠(88.9％、86.5％)明显多于远端结直肠(13.5％、11.1％);Duck's分期中，A+B期(60.3％)明显多于C+D期(39.7％);在病例组与对照组间，CRC亚组与AA亚组间，均存在显著的性别构成比差异(P=0.004，P=0.035)，前者男性所占比例均明显多于后者;对KRAS基因外显子2突变，我们同时检测二个不同长度的片段(155bp和92bp)，发现两者的突变检出率完全一致。
2、在CRC组中，检出19例(19/63，30.1％)KRAS突变，15例(15/63，23.8％)TP53突变。发现各基因突变频率与性别、部位、分化度、组织类型、大小、Duck's分期、年龄均无统计学上差异。3、在AA组中，检出11例(11/52，21.2％)KRAS突变，10例(11/52，19.2％)TP53突变。发现TP53突变与年龄分组存在差异(P=0.036)，发现年龄≥60岁组突变检出率32.0％(8/25)高于＜60岁组7.4％(2/27)。但发现各基因突变频率与性别、部位、异型增生度、组织类型、大小均无统计学差异。
4、两基因联合突变发生率，CRC中为54.0％(34/63)，AA中为40.4％(21/52);联合检测粪便DNAKRAS与TP53基因突变筛查CRC与AA的性能欠佳，敏感度分别为54％[95％CI0.41，0.66]与40％[95％CI0.27，0.55]，特异度均为97％[95％CI0.87，0.99]，准确性分别为75％与71％。
结论：
“学习集”阶段
1、在CRC与AA患者的组织样本中，HRMA检测KRAS外显子2-3与TP53外显子5-8基因突变准确性与DNA测序结果完全一致，其敏感性与特异度均达100％。
2、在其相应的粪便DNA样本中，HRMA检测KRAS外显子2-3与TP53外显子5-8基因突变准确性与DNA测序结果完全一致，其敏感性与特异度均达100％。
3、粪便DNA突变检出率与组织DNA突变检测出率的符合率高度一致，Kappa值为0.794，在CRC、AA中分别为0.794、0.814。
HRMA的敏感性分析
在野生型基因稀释的背景下，这可粗略估计出HRMA检测突变的敏感性能达1％稀释浓度，并且发现待检样本的序列变异直接影响HRMA检测的灵敏度，因此HRMA能稳定可靠地检出突变的敏感性是≥5％稀释浓度。
“验证集”阶段
1、病例组基因突变检出率(49.3％，37/75)显著高于对照组(3.3％，2/60)。表明KRAS和/或TP53基因突变与大肠肿瘤性病变相关。
2、CRC患者基因突变检出率的显著高于AA患者，表明KRAS和/或TP53基因突变与CRC关系更密切。
3、HRMA检测基因突变的结果均能被随后的测序所证实，其检测粪便DNA突变的敏感度与特异度均达100％。
粪便基因突变与临床病理特征参数关系及临床诊断价值
1、在所有病例患者的粪便DNA样本中，KRAS突变检出率为26.1％(30/115)，TP53突变检出率为21.7％(25/115);CRC、AA原发于近端结直肠多于远端结直肠;Duck's分期中，较早期病变(A+B期)明显多于较晚期(C+D期);在病例组与对照组间、CRC亚组与AA亚组间，均存在显著的性别差异，前者男性所占比例均明显多于后者;同一基因的不同长度片段(155bp和92bp)对HRMA的突变检出率无影响。
2、病例组中，均未发现KRAS、TP53各基因突变频率与性别、部位、分化度/异型增生度、组织类型、大小、Duke's分期、年龄存在相关性。
3、在AA组中，发现TP53突变与年龄相关，高龄组(年龄≥60岁)检出率高于低龄组(年龄＜60岁)。
4、联合检测粪便DNAKRAS与TP53基因突变(CRC54.0％(34/63);AA40.4％(21/52))诊断CRC与AA的敏感度欠佳，分别为54％与40％，特异度均为97％。
关健词:高分辩率熔解曲线分析技术(HRMA);粪便DNA;结直肠肿瘤;诊断性能
高分辩率熔解曲线分析技术;粪便DNA;结直肠肿瘤;诊断性能;临床病理;基因突变
南方医科大学
博士
内科学(消化系病)
许岸高
2012
中文
R735.37
120
2013-04-26（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）