氩氦冷冻/微波消融序贯131i-chTNT瘤内注射治疗小鼠lewis肺癌的实验研究
肿瘤坏死疗法(tumornecrosistreatment，TNT)最早是由美国南加州大学Epstein教授提出，是一种针对实体肿瘤的放射免疫治疗，其结合的位点是肿瘤细胞变性坏死后暴露的核抗原。肿瘤组织中存在自发性坏死，坏死区域暴露出来的肿瘤细胞核抗原可以与TNT抗体结合。正常组织由于有网状内皮系统的监控，不存在坏死区域，所以TNT具有广谱性和特异性。已有实验证实TNT可以和人、小鼠等多种哺乳动物的肿瘤细胞核抗原结合。131I-肿瘤细胞核人鼠嵌合单克隆抗体(131I-chimerictumornecrosistherapymonoclonalantibody，131I-chTNT)是全球首个上市的实体瘤RIT药物，它由特异识别肿瘤的抗体和杀伤肿瘤的放射性核素构成，属于标准的放射免疫治疗药物。但是肿瘤组织的自发性坏死区域有限，扩大肿瘤组织的坏死区域才能增加131I-chTNT结合的位点，增加肿瘤组织对131I-chTNT的摄取从而增加其疗效。临床上温度消融包括热消融和冷消融，以微波消融和氩氦冷冻为代表。氩氦冷冻、微波消融可以增大肿瘤的坏死，理论上与131I-chTNT联合可以增加其疗效。有报道微波消融序贯131I-chTNT瘤内注射可以增加131I-chTNT在肿瘤组织中的浓聚。氩氦冷冻、微波消融序贯131I-chTNT瘤内注射的差异尚未见报道，有待研究。
我们设计本实验，将氩氦冷冻、微波消融与131I-chTNT结合起来。（一）先模拟氩氦冷冻、微波消融处理Lewis肺癌细胞，再与131I-chTNT结合，在细胞水平初步检验两者与131I-chTNT结合差异，为动物实验提供参考;（二）对Lewis肺癌进行氩氦冷冻、微波消融，产生坏死区域，然后注射131I-chTNT。观察氩氦冷冻、微波消融Lewis肺癌序贯131I-chTNT瘤内注射后肿瘤经两种消融坏死与131I-chTNT结合差异及疗效差异，为临床联合应用提供理论依据。
第一章，模拟氩氦冷冻/微波消融序贯131I-chTNT对Lewis肺癌细胞的对照研究
目的：
Lewis肺癌细胞经热灭活、冷冻灭活后序贯131I-chTNT，探讨肿瘤细胞经模拟氩氦冷冻、微波消融坏死后与131I-chTNT结合差异。
方法：
1.取对数生长期细胞分为A、B、C组，A组为对照组，不做处理;B组为模拟微波消融组，B组细胞放入37℃水中加热，等温水煮沸后维持10min;C组为模拟氩氦冷冻组，C组细胞放入液氮中5min后取出常温融化，两个循环。B、C组台盼兰染色检测坏死均应达到100％坏死。每组每管加入0.001mci131I-chTNT后37℃条件下共孵育30min，然后在低温高速离心机下12000rpm离心5min，弃上清后PBS洗涤，以上过程重复3次。使用γ计数仪测量放射性计数，比较3组细胞与131I-chTNT结合差异。
2.统计学处理:采用SPSS13.0软件进行统计。计量资料数据以(x)±S表示，每组放射性计数差异采用单向方差分析(One-wayANOVO)，方差齐时多组间比较采用LSD法，若检验方差不齐，整体比较采用Welch校正方法，组间比较采用Dunnett's。P＜0.05为差异有统计学意义。
结果：
B、C组的放射性计数高于A组，C组的放射性计数高于B组(P＜0.05)
结论：
氩氦冷冻、微波消融处理Lewis细胞可以提高131I-chTNT与肿瘤坏死细胞的结合;与微波消融相比，氩氦冷冻更有利于131I-chTNT与肿瘤坏死细胞的结合。
第二章，经皮氩氦冷冻/微波消融序贯131I-chTNT瘤内注射对Lewis肺癌的对照研究
目的：
经皮氩氦冷冻、微波消融Lewis肺癌后序贯131I-chTNT瘤内注射，探讨肿瘤经两种消融坏死后与131I-chTNT结合差异。
方法：
1.建立C57BL/6小鼠Lewis瘤模型:C57BL/6小鼠90只，取对数生长期的Lewis细胞，接种于6周龄C57BL/6小鼠的右侧后肢皮下。3周左右，肿瘤最大直径达到15mm时开始试验。
2.荷瘤小鼠的分组和处理:按照肿瘤大小均一性原则挑选75荷瘤小鼠进行试验，按照完全随机化原则随分成A、B、C组，A组为单药组，B组为微波消融联合组，C组为氩氦冷冻联合组，每组25只荷瘤小鼠，其中20只用于测量131I-chTNT在肿瘤组织中的分布，剩下的5只用于核素扫描。A组，单药组，单纯肿瘤中心注射先131I-chTNT，每只荷瘤小鼠18.5MBq/0.05ml;B组，先给予微波消融，5天后在消融范围中心注射131I-chTNT，方法和剂量同A组;C组，先给予氩氦冷冻，5天后在消融范围中心注射131I-chTNT，方法和剂量同A组。
3.131I-chTNT在小鼠肿瘤内的分布情况:注射131I-chTNT药物后第1、3、5、7天处死A、B、C组小鼠，每组每次5只，取肿瘤组织称重并用γ计数仪测定其放射性计数，计算每克组织的摄取率(％ID/g)。
4.荷瘤小鼠的活体核素扫描成像:A、B、C每组分别取5只荷瘤小鼠。注射31I-chTNT药物后第1、3、5和7天分别行核素扫描成像。采用ROI技术，选取肿瘤组织(T)及对侧相应部位的同等大小的区域（NT)，测量放射性计数，分析T/NT放射性药物摄取比值。
5.统计学处理:采用SPSS13.0软件进行统计。计量资料数据以(x)±S表示，药物在小鼠肿瘤组织中的分布差异采用析因设计资料的方差分析。放射性药物摄取比值(T/NT)的比较采用重复测量的方差分析，不满足球形假设是采用Greenhouse-Geisser校准系数。P＜0.05为差异有统计学意义。
结果：
1.各组小鼠肿瘤内药物分布:B、C组每克肿瘤组织的摄取率(％ID/g)高于A组，C组与B组相比，前者的每克肿瘤组织的摄取率(％ID/g)更高。
2.荷瘤小鼠的活体核素扫描成像:各组注射药物1天后，肿瘤组织区域有明显的放射性浓聚。A组、B组和C组均在给药后第5天时肿瘤部位放射性浓聚最高，至第7天仍可见肿瘤显影。B、C组肿瘤部位放射性浓聚高于A组，C组与B组相比前者肿瘤部位放射性浓聚高。
3.T/NT比值情况:各组肿瘤组织与非肿瘤组织的药物分布存在显著差异，B、C组的T/NT显著高于A组，C组与B组相比，前者的T/NT更高。
结论：
氩氦冷冻、微波消融可以促进131I-chTNT在肿瘤内浓聚，氩氦冷冻和微波消融序贯131I-chTNT瘤内注射相比前者有利于其在小鼠肿瘤组织的浓聚。
第三章,经皮氩氦冷冻/微波消融序贯131I-chTNT瘤内注射治疗Lewis肺癌的疗效研究
目的：
研究药物经瘤内注射后在瘤内的分布情况，观察经皮氩氦冷冻/微波消融序贯131I-chTNT瘤内注射治疗Lewis肺癌的疗效差异。
方法：
1.建立C57BL/6小鼠Lewis瘤模型:C57BL/6小鼠60只，取对数生长期的Lewis细胞，接种于6周龄C57BL/6小鼠的右侧后肢皮下。3周左右，肿瘤最大直径达到15mm时开始试验。2.荷瘤小鼠的分组和处理:按照肿瘤大小均一性原则挑选45只荷瘤小鼠进行试验，按照完全随机化原则随分成A、B、C、D、E、F组，A组为单药组，10只小鼠，肿瘤中心注射131I-chTNT，每只荷瘤小鼠18.5MBq/0.05ml;B组为微波消融联合药物中心注射组，10只小鼠，先对肿瘤进行微波消融，5天后在消融范围中心注射131I-chTNT，方法及剂量同A组;C组为氩氦冷冻联合药物中心注射组，10只小鼠，先对肿瘤进行氩氦冷冻，5天后在消融范围中心注射131I-chTNT，方法及剂量同A组;D组，单纯微波组，5只小鼠，对肿瘤进行微波消融;E组，单纯氩氦冷冻组，5只小鼠，对中心进行氩氦冷冻;F组，对照组，5只小鼠，肿瘤中心注射0.05ml生理盐水。
3.放射自显影及HE染色观察:A、B、C三组小鼠，每组5只，注射药物后3天分别处死各组小鼠。取小鼠的肿瘤组织，常规做病理切片，每个标本做连续2个切片，相邻切片分别给予放射自显影和HE染色。观察放射自显影和HE染色的图片，比较不同处理组之间肿瘤坏死区域的放射性分布。
4.疗效观察:接种Lewis细胞后每天观察小鼠的食欲、运动、毛色和精神状态的变化情况。注射药物后用游标卡尺每3天测量一次肿瘤的最大直径(a)和最小直径(b)，直到第28天。根据体积计算公式V=(a×b2)/2计算肿瘤的体积大小，绘制小鼠肿瘤体积的生长变化曲线。
5.统计学处理:采用SPSS13.0软件进行统计，计量资料数据以(x)±S表示，小鼠肿瘤的体积变比较采用重复测量(RepeatedMeasureANOVA)的方差分析，不满足球形假设是采用Greenhouse-Geisser校准系数，P＜0.05为差异有统计学意义。
结果：
1.药物在瘤内的分布情况:各组用药后3天肿瘤组织切片的放射性自显影和HE染色提示:A组中的肿瘤组织自发性坏死区域少，药物在瘤内的分布也随之少;B、C组的肿瘤坏死区域明显大于A组，药物在瘤内的分布也多;B组与C组相比较，后者的坏死区域大于前者，后者的药物在瘤内的分布也多于前者。
2.药物特异性结合的验证:对比放射自显影图片和HE染色的图片，可以看到只有坏死区域才能和药物结合，非坏死区域没有药物结合。
3.药物疗效的观察:各个不同处理组小鼠的肿瘤生长情况出现差异;B、C组肿瘤生长显著减慢，体积显著小于A、D、E、F组;B组与C组相比，后者肿瘤生长慢于前者，体积也小于前者。
结论：
131I-chTNT只于肿瘤坏死区域特异性结合，非坏死区域不结合;在注射131I-chTNT前先给予氩氦冷冻和微波消融，可增加药物在肿瘤组织内的浓聚，从而增加其疗效;氩氦冷冻和微波消融序贯131I-chTNT瘤内注射相比前者有利于其在小鼠肿瘤组织的浓聚，从而增加其疗效。
肺癌细胞;氩氦冷冻;微波消融;肿瘤坏死疗法;瘤内注射;肿瘤细胞核人鼠嵌合单克隆抗体
南方医科大学
硕士
肿瘤学
张积仁
2012
中文
R734.2
61
2013-04-26（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）