骨髓间充质干细胞的体外培养及体内移植实验性研究
病毒性肝炎是一种严重威胁人类健康的常见病，特别是乙型肝炎病毒(HBV)所引起的乙型病毒性肝炎，全球约有3亿以上慢性病毒性肝炎及其病毒携带者，而我国是一个病毒性肝炎大国，约有1.2亿慢性病毒性肝炎感染者。由于各种原因所引起的病毒反复活动破坏肝实质细胞，可引起肝细胞的变性、坏死，纤维组织增生和肝细胞结节状再生，从而进一步发展为肝硬化甚至肝癌，已成为威胁肝病患者生命的主要原因。目前原位肝移植(OLT)是治疗各种肝功能失代偿期、肝功能衰竭期最有效的治疗方法，但因为肝源缺乏、费用昂贵、以及移植后的并发症等限制了OLT的广泛应用。
近年来，新的干预性治疗不断出现，通过进行干细胞移植，利用外源性的具有高度增殖活性和多向分化能力的干细胞移植来达到损伤组织或细胞的修复与再生的目的。间充质来源的成体干细胞称间充质干细胞(MSC)，其概念最初是由Friedenstein和同事于20世纪70年代提出的，Friedenstein和同事在培养骨髓细胞时发现一种与成纤维细胞形态相似，贴壁生长的梭形细胞，有集落形成能力，在体内和体外均可分化为成骨细胞、成软骨细胞与基质细胞。目前证实间充质干细胞存在于机体的多种组织中，包括脐带、脐带血、骨髓、脂肪、外周血、骨骼肌等。骨髓间充质干细胞(BMSCs)是指来源于骨髓的间充质干细胞，是间充质干细胞所有种类中来源最丰富和应用最广泛的一种细胞。体外大量研究证实了骨髓间充质干细胞有着高度的自我更新能力和较强的多胚层分化潜能，在特定因素诱导下可以分化为骨细胞、软骨细胞、骨骼肌细胞、脂肪细胞、内皮细胞、心肌细胞、星形胶质细胞、神经细胞和肝细胞。
大量动物实验及临床研究表明，骨髓来源间充质干细胞移植用于治疗肝脏相关性疾病中可获得以下效果:先天性肝脏代谢缺陷疾病的纠正，可改善肝性脑病症状，暂时性替代部分肝细胞和肝脏组织的功能，提高血清白蛋白水平，降低血清转氨酶、血氨及总胆红素水平。随着干细胞研究的深入，BMSCs移植在不久的将来会成为临床肝脏疾病治疗的常规手段。
目的:
1、探索体外分离纯化、冻存大鼠骨髓间充质干细胞( Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)的最适方法，探讨体外培养BMSCs是否具有成瘤性，为其成为组织工程与临床康复理想的种子细胞提供实验依据。
2、探索不同途径移植GFP标记的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)在慢性肝纤维化的作用，以及移植后细胞在肝脏组织内存活、分布情况，为临床BMSCs应用提供理论基础。
方法:
1、购清洁级别SD雄性大鼠，6只，1月龄，利用冲洗骨髓腔的方法所获得大鼠BMSCs，加入含10％胎牛血清的低糖DMEM培养基，吹打混匀后给予相应的处理。A组给予1.5h弃贴壁细胞，24h首次换液后继续培养;B组24h首次换液后继续培养;C组48h首次换液后培养。显微镜下观察细胞贴壁情况及形态学变化。
2、待P3细胞长至80％—85％汇合，消化细胞后向沉淀物中加入血清浓度分别为10％、20％、30％、40％、50％的细胞冷冻液，轻轻吹打混匀，使细胞密度达1×106个/mL后置于梯度冻存盒，-80℃冰箱短期保存。1月后行冻存细胞复苏。轻轻吹吸混匀后分为三组，A组细胞复苏后行台盼蓝染色，计算细胞存活率;B组细胞悬液接种到96孔板培养，分别在接种后第1到8天每天取3个孔，行活细胞计数后绘制出细胞生长曲线;C组成脂诱导培养D21天后行油红O染色，观察复苏后细胞成脂能力。
3、购SPF级裸鼠，6只，1月龄，实验组将P3、P15代大鼠骨髓间充质干细胞行免疫组织化学染色和成脂诱导鉴定后，分别通过裸鼠后肢股四头肌肌肉、肝脏组织局部注射体内移植，对照组以生理盐水局部注射至相应部位。观察裸鼠生存状态及接种部位有无新生物形成，45天后行注射部位病理组织标本HE染色检查观察有无异型细胞生长。
4、购清洁级SD雄性大鼠，15只，300±50g，将苯巴比妥钠注射液350mg/L混于纯水中供大鼠饮用，7天后按每100g0.125ml/四氯化碳橄榄油混合液(2∶3)给予大鼠灌胃，2次/周，持续8周。8周后将存活下来的肝硬化模型大鼠行肝功能检测，根据检测结果将成功造模的肝硬化大鼠随机分为尾静脉移植组、肝脏局部注射组、肝动脉注射组、肝门静脉注射组和肝硬化未移植组。
5、购清洁级SD雄性大鼠，2只，1月龄，利用全骨髓差速贴壁法分离、培养骨髓间充质干细胞，取第三代骨髓间充质干细胞，一部分用于CD34、CD44免疫组织化学染色和成脂诱导鉴定，一部分利用携带EGFP基因的慢病毒载体感染标记骨髓间充质干细胞。
6、通过尾静脉、肝脏局部注射、肝动脉注射、肝门静脉四种注射途径将标记好的BMSCs移植到肝硬化模型大鼠体内，移植后维持四氯化碳肝损伤，1月后处死大鼠检测血清白蛋白、谷丙转氨酶、谷草转氨酶指标;取肝脏组织行HE染色和天狼星红-苦味酸染色观察肝硬化程度;取肝脏组织白片在荧光显微镜下观察切片组织荧光分布情况。
结果:
1、A组可见大量骨髓间充质干细胞贴壁生长，多为短梭形和不规则三角形，核椭圆形，较大，有的可见双核， B组、C组除了可见短梭形细胞外，还可见较大的圆形细胞及长梭形细胞贴壁，细胞组成形态较A组复杂。
2、冻存与复苏对骨髓间充质干细胞的存活和增殖能力存在一定的影响，细胞生长潜伏期延长，随着血清浓度的递减这种影响也愈加明显;接种密度偏高利于细胞复苏后生长与增殖，含30％血清组接种密度过低，细胞生长速度较其他各组慢，但待细胞增殖到某一数量后细胞增殖速度明显加快。
3、BMSCs传至15代仍保持间充质干细胞特性，BMSCs移植入裸鼠肝脏45天后可在局部肝脏存活，生长状态与体外培养相似，无异型性及向周围浸润生长。
4、全骨髓差速贴壁法24h后给予全量换液去除未贴壁细胞后，可见散在贴壁细胞，形态较为均一，成短梭形或星形。随着培养天数的增长，逐渐出现放射状排列的细胞集落。7-12天细胞增殖旺盛，集落逐渐融合，排列紧密并成旋涡状。P3代细胞免疫组织化学染色CD34-，CD44+，成脂诱导油红O染色(+)，具有骨髓间充质干细胞的生物学特性。
5、肝功能检测提示苯巴比妥联合四氯化碳诱导大鼠慢性肝纤维化损伤持续8周（移植前）各组白蛋白( Alb)水平均较正常大鼠低，谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)活性均较正常大鼠高，移植后各组Alb持续性下降，谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平因肝损伤刺激的减少也逐渐下降，且各组下降幅度相当。
6、不同途径大鼠骨髓间充质干细胞移植后肝脏组织病理组织切片HE染色示正常肝小叶结构破坏，肝细胞排列紊乱，可见大量肝细胞空泡变性，门管区有广泛的胶原纤维增生，向小叶内伸展，形成假小叶。天狼猩红-苦味酸染色示骨髓间充质干细胞移植组和对照生理盐水注射组在肝门静脉区和肝实质内均有大量红染胶原纤维沉积，形成假小叶。
7、经GFP标记的骨髓间充质干细胞与P3代骨髓间充质干细胞形态类似，随着体外培养时间的延长，细胞的绿色荧光逐渐减退，变成黄绿色甚至黄色。移植后四周肝脏局部组织切片免疫荧光显微镜下观察示:尾静脉移植组在门管区纤维间隔内可见大量表达黄色荧光信号的细胞，局部注射组、肝动脉组、门静脉组亦分别在局部注射部位、小叶间动脉、小叶间静脉（中央静脉）等部位见到黄色荧光表达，且均分布在胶原纤维含量较多的部位。
结论:
1、本实验首次利用1.5h差速贴壁结合24h首次全量换液法，在原代即可获得形态均一、增殖速度快、性状稳定的BMSCs，且具有操作简单、快捷、实用、对细胞损伤小等优点，为其作为组织工程种子细胞提供了实验基础。
2、含30％浓度的血清冻存液冻存骨髓间充质干细胞，既可最大化的保证骨髓间充质干细胞活性及增殖能力，又可保证其遗传特性和多分化的能力。
3、体外长时间培养BMSCs在15代以内移植入裸鼠体内可以在局部肝脏内存活，且没有成瘤性，随着体外培养传代次数的增多其具有成瘤性的风险增加。
4、免疫荧光显微镜下观察表达荧光信号的细胞在肝小叶内的分布不同，考虑可能与细胞移植途径有关，但均分布在肝小叶汇管区或小叶血管周围胶原纤维沉积较多的部位。
5、各组肝功能检测、HE染色及胶原纤维染色结果提示单纯进行BMSCs移植各组的肝功能均未得到明显的改善，而肝纤维化程度也没有得到减轻，甚至表现为更进一步的加重
6、临床上通过介入手段经肝动脉移植BMSCs已成为常见治疗手段，在移植同时可进行肝动脉造影，进行鉴别诊断，分区栓塞化疗等可以作为首选移植方法。但经外周静脉移植操作简单，创伤少，死亡率低，可作为动物实验体内移植首选方法
骨髓间充质干细胞;细胞移植;临床疗效;病毒性肝炎;体外培养
南方医科大学
硕士
内科学(传染病学)
佟明华
2012
中文
R512.6
58
2013-04-26（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）