吉非替尼通过EGFR/AKT/β-catenin途径抑制鼻咽癌肿瘤干细胞
研究背景和目的:
越来越多的证据显示，肿瘤中存在少量具有干细胞特质的细胞。称为肿瘤干细胞[1]。肿瘤干细胞具有许多独特表型，如高度的自我更新和异常的分化潜能，抗凋亡因子的高表达，多种药物泵分子的存在，高DNA修复能力及对外界毒素的解毒能力[2]。这些特性可能与对现行治疗的耐受性密切相关。由于对抗肿瘤治疗具有原发性或者获得性耐受，肿瘤干细胞在治疗后存活下来，并成为复发的根源。通过特异性药物减少其中关于生长，存活以及抵抗信号，对于那些高度恶性、复发转移等威胁生命的癌症，具有巨大的治疗意义。而且理解在肿瘤发生发展过程中复杂的基因变化过程，并进行针对性治疗，要比仅仅对现有手段进行新的排列组合，具有更大的实际意义[3]。
首先被确定对肿瘤干细胞具有选择性杀伤作用的药物是盐霉素，采用的手段是高通量大规模的筛选[4]。随着对肿瘤干细胞特性认识的加深和实验技术的改进，多种生物活性药物被证明对肿瘤干细胞具有特异性的抑制作用。如针对干细胞标志CD133，CD44的单抗[5-6];抑制ABC泵的小分子物质MS-209(Dofequidarfumarate)，维拉帕米和ABCG5单抗[7-9];抑制重要毒物代谢酶ALDH的全反式维甲酸[10];干扰肿瘤微环境的抗体anti-VEGF（bevacizumab）和anti-VEGFR2(DC101)[11-12];信号通路抑制剂[13-16]。联合应用常规抗肿瘤手段和针对肿瘤干细胞的治疗，对肿瘤的生长和转移可以起到更好的抑制作用。
鼻咽癌是广东地区高发肿瘤，对人民的生命健康造成巨大的威胁[17]。虽然经过多年的努力，联合应用包括放疗，化疗和靶向治疗等多种治疗手段，疗效始终在低水平徘徊。肿瘤干细胞理论对这一问题提出了新的理解和治疗前景。即传统的治疗手段仅仅针对肿瘤细胞群体中的普通细胞，对肿瘤干细胞没有作用。必须联合应用针对肿瘤干细胞的治疗手段，才能够最终达到治愈的水平。已有研究对此进行了一定的探讨。通过侧群细胞，CD133和CD44阳性细胞对鼻咽癌中的肿瘤干细胞进行了分离与鉴别[18-19]。而且证实放化疗可以引起肿瘤细胞染色质的混乱，从而富集肿瘤干细胞[20]。在这些研究基础上对鼻咽癌肿瘤干细胞调节机理进行进一步研究，并发现具有抑制作用的手段具有重要的诊疗意义。
通过本次研究我们试图证明，EGFR/AKT/β-catenin信号通路对鼻咽癌肿瘤于细胞具有重要的调节，EGFR受体酪氨酸激酶特异性抑制剂吉非替尼对鼻咽癌肿瘤干细胞具有选择性抑制作用。
研究内容及方法:
一.EGFR/AKT/β-catenin信号通路对鼻咽癌肿瘤干细胞具有调节作用
1.采用免疫组化手段检测EGFR受体在鼻咽癌组织中的表达，确实EGFR受体确实在鼻咽癌人体组织标本中表达情况。采用WestenBlot方法检测EGFR受体在鼻咽癌细胞株CNE-1，CNE-2，5-8F,6-10B，HNE-1，HONE-1，C-666-1中的表达情况。
2.采用WestenBlot方法检测EGFR信号通路分子在不同信号作用下在鼻咽癌细胞中的变化情况。选取CNE-1，CNE-2细胞株，分别用EGFR配体EGF，特异性抑制剂吉非替尼和PD153035;AKT特异性抑制剂LY294002;ERK特异性抑制剂PD032590等试剂进行处理，检测P-EGFR，EGFR，P-AKT,AKT,P-ERK，ERK等通路分子蛋白表达情况。
3.采用细胞免疫荧光技术检测β-catenin在EGFR配体EGF，特异性抑制剂吉非替尼，AKT特异性抑制剂LY294002作用下β-catenin的表达情况。
4.采用侧群细胞检测，ALDFLOUR检测两种手段作为鼻咽癌肿瘤干细胞检测指标。分别检测EGFR配体EGF，特异性抑制剂吉非替尼和PD153035;AKT特异性抑制剂LY294002;ERK特异性抑制剂PD032590对肿瘤干细胞的影响。
5.野生型AKT1表达质粒pcDNA3-FLAG-AKT1和活化型AKT1质粒pcDNA3-Myr-FLAG-AKT1见先前报导(Xiao，2001，PNAS)。分别采用空白质粒pcDNA3-FLAG，野生型质粒pcDNA3-WT-AKT1和活化型质粒pcDNA3-myr-AKT1转染肿瘤细胞CNE-1，CNE-2，经过G418筛选，获得AKT1过表达细胞株。分别采用侧群细胞检测，ALDFLOUR检测指标检测EGFR配体EGF，特异性抑制剂吉非替尼对肿瘤干细胞的影响。
6.构建pLVTHM-β-catenin干扰慢病毒，感染肿瘤细胞CNE-1，CNE-2。流式细胞仪GFP筛选。获得β-catenin干扰细胞。分别采用侧群细胞检测，ALDFLOUR检测指标检测EGFR配体EGF对肿瘤干细胞的影响。
7.野生型β-catenin质粒pcDNA3-β-catenin和活化型β-catenin质粒pcDNA3-β-cateninS33Y由美国密执安大学孙笃新教授惠赠。分别采用空白质粒pcDNA3，野生型质粒pcDNA3β-catenin和活化型质粒pcDNA3β-cateninS33Y转染肿瘤细胞CNE-1，CNE-2，经过G418筛选，获得β-catenin过表达细胞株。分别采用侧群细胞检测，ALDFLOUR检测指标检测EGFR特异性抑制剂吉非替尼对肿瘤干细胞的影响。
二.吉非替尼选择性抑制肿瘤干细胞
1.采用MTT法检测吉非替尼对鼻咽癌细胞的抑制作用。
2.采用流式细胞仪分离侧群细胞，采用MTT法检测侧群细胞与主群细胞在对吉非替尼耐受性上的差异。
3.采用侧群细胞检测，ALDFLOUR检测，肿瘤球培养三种分别检测EGF和吉非替尼对肿瘤干细胞的影响。
4.采用裸鼠种植瘤作为动物模型，观察空白对照，吉非替尼和顺铂对肿瘤的抑制作用。
5.分离肿瘤细胞，分别采用侧群细胞检测，ALDFLOUR检测指标检测活体肿瘤组织不同处理后肿瘤干细胞的变化。
6.采用免疫组化技术，分别检测肿瘤组织内P-EGFR,EGFR,P-AKT,AKT1等信号分子和β-catenin，Nanog等干细胞相关分子的表达。
7.采用二次成瘤模型，对初次成瘤细胞的成瘤性做出再次检测。确实不同处理情况下肿瘤干细胞的变化情况。
三.统计学方法
采用统计软件SPSS13.0对实验结果进行统计学处理和分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示。鼻咽癌组织中EGFR，β-catenin和Nanog的表达分析采用Fisher确切概率法;侧群比例分析采用单因素方差分析(One-wayANOVA)比较各组差异，如方差齐性，多重比较采用LSD法，如方差不齐，采用Welch值，多重比较采用DunnettT3法;两处理组肿瘤球数量比较采用两独立样本T检验。P＜0.05被认为有统计学差异。
结果:
一.EGFR/AKT/β-catenin信号通路对鼻咽癌肿瘤干细胞具有调节作用
1.采用免疫组化手段检测EGFR受体在鼻咽癌组织中呈现高表达，表达形式为膜表达。采用WestenBlot方法检测EGFR受体在鼻咽癌细胞株CNE-1，CNE-2，5-8F,6-10B，HNE-1，HONE-1，C-666-1中的表达情况。结果显示，EGFR在CNE-1，CNE-2，5-8F,6-10B，HNE-1，HONE-1细胞株中呈现高表达，C-666-1细胞株没有EGFR表达。
2.采用WestenBlot方法检测EGFR信号通路分子在不同信号作用下在鼻咽癌细胞中的变化情况。选取CNE-1，CNE-2细胞株，分别用EGFR配体EGF，特异性抑制剂吉非替尼和PD153035;AKT特异性抑制剂LY294002;ERK特异性抑制剂PD032590等试剂进行处理，检测P-EGFR，EGFR，P-AKT,AKT,P-ERK，ERK等通路分子蛋白表达情况。结果显示，鼻咽癌细胞株在EGF刺激下，P-EGFR，P-AKT，P-ERK三种活化状态均呈现高表达。而吉非替尼和PD153035处理后抑制P-EGFR，P-AKT，P-ERK三种活化状态的表达。LY294002处理后对P-AKT抑制较为完全，对P-EGFR，P-ERK抑制效力较弱。PD032590处理后对P-ERKP-AKT抑制较为完全，对P-EGFR，P-AKT抑制效力较弱。总蛋白EGFR,AKT,ERK在不同处理状态下差异不大。CNE-1，CNE-2两种细胞株的变化模式仅仅略有差异。结果表明，EGFR信号通路各个分子在鼻咽癌细胞株中均有表达，并且可以在外界刺激下产生相应变化。
3.采用细胞免疫荧光技术检测β-catenin在EGFR配体EGF，特异性抑制剂吉非替尼，AKT特异性抑制剂LY294002作用下β-catenin的表达情况。结果显示，β-catenin在鼻咽癌肿瘤细胞中仅有少量表达，并且以膜表达为主。EGF作用后β-catenin明显增强，并且在一部分细胞中出现明显的核表达。
4.采用侧群细胞检测，ALDFLOUR检测两种手段作为鼻咽癌肿瘤干细胞检测指标。分别检测EGF，吉非替尼和PD153035，LY294002;PD032590对肿瘤干细胞的影响。结果发现，EGF刺激后侧群细胞和ALDH+细胞比例明显增加，吉非替尼和LY294002作用后侧群细胞和ALDH+细胞比例明显受到抑制。PD153035对侧群细胞和ALDH+细胞比例的作用类似于吉非替尼。PD032590作用后侧群细胞和ALDH+细胞比例也受到一定程度的抑制，但没有另外三种抑制剂的抑制作用强烈。CNE-1，CNE-2两种细胞株的变化模式基本相同。
5.分别采用空白质粒pcDNA3-FLAG，野生型质粒pcDNA3-FLAG-AKT1和活化型质粒pcDNA3-myr-FLAG-AKT1转染肿瘤细胞CNE-1，CNE-2，经过G418筛选，获得AKT过表达细胞株。采用WesternBlot实验和细胞免疫荧光实验验证转染效果。分别采用侧群细胞检测，ALDFLOUR检测指标检测特异性抑制剂吉非替尼对肿瘤干细胞的影响。WesternBlot实验结果证明，转染后细胞高表达标识蛋白FLAG。细胞免疫荧光实验证明，正常肿瘤细胞中有少量的AKT1表达，转染后细胞AKT1表达明显增强。两项实验均证实转染成功。然后分别采用侧群细胞检测，ALDFLOUR检测指标检测吉非替尼在AKT1过表达情况下对肿瘤干细胞的影响。结果显示，AKT1过表达细胞株侧群细胞和ALDH+细胞比例明显高于正常细胞株;并且在吉非替尼处理后，侧群细胞和ALDH+细胞比例仅有轻度的下降，与正常细胞株对照有明显差异。CNE-1，CNE-2两种细胞株的变化模式基本相同。结果证明，AKT1过表达可以明显对抗吉非替尼对鼻咽癌肿瘤干细胞的抑制情况。
6.构建pLVTHM-β-catenin干扰慢病毒，感染肿瘤细胞CNE-1，CNE-2。流式细胞仪GFP筛选。获得β-catenin干扰细胞。采用WesternBlot实验验证转染效果。分别采用侧群细胞检测，ALDFLOUR检测指标检测EGFR配体EGF对肿瘤干细胞的影响。WesternBlot实验结果证明，正常肿瘤细胞中有一定的β-catenin表达，干扰后细胞β-catenin表达明显下降。实验证实转染成功。然后分别采用侧群细胞检测，ALDFLOUR检测指标检测EGF在β-catenin干扰情况下对肿瘤干细胞的影响。结果显示β-catenin干扰细胞株侧群细胞和ALDH+细胞比例明显低于正常细胞株;并且在EGF处理后，侧群细胞和ALDH+细胞比例仅有轻度的上升，与正常细胞株对照有明显差异。CNE-1，CNE-2两种细胞株的变化模式基本相同。结果证明，β-catenin干扰可以明显对抗EGF对鼻咽癌肿瘤干细胞的促进情况。
7.分别采用空白质粒pcDNA3，野生型质粒pcDNA3-β-catenin和活化型质粒pcDNA3-β-cateninS33Y转染肿瘤细胞CNE-1，CNE-2，经过G418筛选，获得β-catenin过表达细胞株。采用WesternBlot实验验证转染效果。分别采用侧群细胞检测，ALDFLOUR检测指标检测EGFR特异性抑制剂吉非替尼对肿瘤干细胞的影响。WesternBlot实验结果证明，正常肿瘤细胞中有一定的β-catenin表达，过表达后细胞β-catenin表达明显增强。实验证实转染成功。然后分别采用侧群细胞检测，ALDFLOUR检测指标检测EGF在β-catenin过表达情况下对肿瘤干细胞的影响。结果显示β-catenin过表达细胞株侧群细胞和ALDH+细胞比例明显高于正常细胞株;并且在吉非替尼处理后，侧群细胞和ALDH+细胞比例仅有轻度的下降，与正常细胞株对照有明显差异。CNE-1，CNE-2两种细胞株的变化模式基本相同。结果证明，β-catenin过表达可以明显对抗吉非替尼对鼻咽癌肿瘤干细胞的抑制情况。
8.免疫组化检测鼻咽标本显示，EGFR+/β-catenin+同EGFR+/β-catenin-病例数量具有统计学差异(P=0.006);EGFR+/Nanog+同EGFR+/Nanog-病例数量具有统计学差异(P=0.020);β-catenin+/Nanog+同β-catenin+/Nanog-病例数量具有统计学差异(P=0.002)。
二.吉非替尼选择性抑制肿瘤干细胞
1.采用MTT法检测吉非替尼对鼻咽癌细胞的抑制作用。结果显示，吉非替尼对鼻咽癌细胞的生长具有抑制作用。
2.采用侧群细胞检测，ALDFLOUR检测，肿瘤球培养三种分别检测EGF和吉非替尼对肿瘤干细胞的影响。结果显示，对照组，EGF单独处理组，EGF和吉非替尼联合组对细胞侧群比例(P＜0.001)和肿瘤球形成(P＜0.001)影响有差异，EGF可以增加侧群细胞比例，而吉非替尼减少侧群细胞比例。EGF可以增加ALDH+细胞比例，而吉非替尼减少ALDH+细胞比例。
3.采用侧群细胞检测，ALDFLOUR检测，肿瘤球培养三种分别检测EGF和吉非替尼对肿瘤干细胞的影响。结果显示，EGF可以增加侧群细胞比例，而吉非替尼减少侧群细胞比例。EGF可以增加ALDH+细胞比例，而吉非替尼减少ALDH+细胞比例。
4.采用裸鼠种植瘤作为动物模型，观察空白对照，吉非替尼和顺铂对肿瘤的抑制作用。结果显示，吉非替尼对肿瘤有抑制作用，但没有顺铂的抑制效果强烈。但是吉非替尼对动物体重没有明显影响，而顺铂处理后动物体重呈现明显下降。
5.分离肿瘤细胞，分别采用侧群细胞检测，ALDFLOUR检测指标检测活体肿瘤组织不同处理后肿瘤干细胞的变化。结果显示，吉非替尼处理后肿瘤所分离细胞中侧群细胞比例同空白对照处理相比下降，而顺铂处理后细胞中侧群细胞比例同空白对照处理相比上升。与之类似，吉非替尼处理后肿瘤所分离细胞中ALDH+细胞比例同空白对照处理相比下降，而顺铂处理后细胞中ALDH+细胞比例同空白对照处理相比上升。
6.采用免疫组化技术，分别检测肿瘤组织内P-EGFR,EGFR，P-AKT,AKT等信号分子和β-catenin，Nanog等干细胞相关分子的表达。结果显示同空白对照比较，吉非替尼处理后组织P-EGFR，P-AKT表达均下降，EGFR，AKT表达无明显变化，β-catenin，Nanog表达下降;顺铂处理后组织P-EGFR,P-AKT表达均提高，EGFR,AKT表达无明显变化，β-catenin，Nanog表达提高。
7.采用二次成瘤模型，对初次成瘤细胞的成瘤性做出再次检测。确实不同处理情况下肿瘤干细胞的变化情况。结果显示，同空白对照比较，吉非替尼处理后分离细胞成瘤时间延长，成瘤速度减慢;顺铂处理后分离细胞成瘤时间缩短，成瘤速度增加。
结论:
1.EGFR/AKT/β-catenin通路对鼻咽癌肿瘤干细胞有调节作用。
2.吉非替尼通过EGFR/AKT/β-catenin途径抑制鼻咽癌肿瘤干细胞。
本研究创新之处
1.第一次提出EGFR/AKT/β-catenin通路对肿瘤干细胞具有有调节作用
2.第一次提出吉非替尼可以选择性抑制鼻咽癌肿瘤干细胞。
3.第一次证明吉非替尼对鼻咽癌肿瘤干细胞的调节作用是通过EGFR/AKT/β-catenin通路。
吉非替尼;EGFR信号通路;AKT信号通路;β-catenin信号通路;鼻咽癌;肿瘤干细胞
南方医科大学
博士
肿瘤学
肖广惠
2012
中文
R739.63
132
2013-04-26（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）