miRNAs靶向调节人牙周膜细胞骨向分化中PLAP-1基因表达研究
研究背景:
牙周组织(periodontaltissues，PDT)包括牙龈、牙周膜及矿化组织牙骨质和牙槽骨。由于其组成多样性及软、硬结缔组织、上皮之间相互作用使牙周组织发生改建与愈合比一般软组织更复杂。正常牙周组织具有改建再生能力，如牙齿生理移动过程中有牙周膜改建，牙骨质、牙槽骨新骨形成，特别是成骨现象，主要是生理反应，不是病理损伤组织再生。当牙周病理损伤发生炎症时波及牙周膜和牙槽骨，引起牙周附着丧失甚至导致牙齿缺失，其再生能力非常有限，影响功能和美观。现代最有效牙周治疗概念要求实现牙周组织再生(periodontaltissueregeneration，PDTR)，即有新的牙槽骨、牙骨质及插入其中的胶原纤维产生。牙周再生修复是一个复杂的连续过程，其中矿化是牙周硬组织形成的重要阶段，在这一生物矿化过程与钙盐的沉积、碱性磷酸酶活性有关，这是一个重要课题，其中调节牙周组织矿化相关细胞向有利于牙周组织再生方向发展的相关因素研究是未来研究的方向。
牙周膜细胞(periodontalligamentcells，PDLCs)是一个异质性间充质细胞群，组成具有多样性特点，包括成纤维细胞、成骨细胞、成牙骨质细胞以及这些细胞的前体细胞和具有多向分化潜能的干细胞，具有可分化为成骨细胞和成牙骨质细胞等矿化细胞的能力，因此具有极高的骨向分化潜能。有趣的是，在体内正常环境下，PDL为坚韧而富有弹性的结缔组织且终生不被骨质化，保持着一种自身稳定(homeostasisofperiodontium)的动态平衡。牙周膜细胞在维持这种自身稳定的过程中起着极其重要的平衡作用，有研究显示牙周膜细胞相关多种因素如基因、蛋白、细胞因子等参与组织再生和自身稳定平衡过程的调节，而有关牙周膜细胞在组织再生与自身稳定过程中的分子调节机制和分子调节信号通路等之间关系目前尚不清楚。
牙周膜相关蛋白1(periodontalligamentassociatedprotein-1，PLAP-1)是新近发现的牙周组织专一性胞外基质蛋白(Extracellularmatrix，ECM)，是一种牙周膜钙化和矿化调节剂，在牙周膜新陈代谢，牙周组织改建、再生和维持牙周组织稳定中发挥重要作用的基因。2006年由Yamada等.首次发现并命名为PLAP-1，报道其极高表达于牙周组织，证实PLAP-1的表达水平随牙周膜细胞矿化而升高。随后，多家实验室的数据显示，FGF-2抑制PLAP-1的表达，而BMP-2上调PLAP-1的表达;PLAP-1在牙周膜中发挥了负性调节牙周膜细胞分化和矿化的作用，阻止牙周组织发生非生理状态下的骨化;以小鼠牙周膜细胞为模型，过表达PLAP-1使得碱性磷酸酶活性和形成矿化结节的能力受到抑制，通过调节BMP-2的活性抑制了牙周膜细胞的分化和矿化;PLAP-1阻碍BMP-2与其受体BMPR-IB的结合，抑制了BMP-2信号通路，从而抑制了矿化分化。PLAP-1在牙周韧带中的表达受到矿化相关因子FGF，Smad，BMP-2，Runx2等影响，但具体的分子调节机理，尤其对PLAP-1基因转录后水平的调节机理目前尚不明了。
microRNAs(miRNAs)是一类进化上保守的非编码小分子RNA，广泛存在于真核生物中，是一组不编码蛋白质的短序列RNA，它本身不具有开放阅读框(ORF)，通常的长度为20～24nt，但在3'端可以有1～2个碱基的长度变化，具有在翻译水平调控基因表达的功能。尤其miRNAs是参与靶基因功能作用调节的重要因子，具有组织特异性和时序性，在转录后水平抑制或降解蛋白翻译，成为近几年的研究热点。有关牙周膜细胞骨向分化调节组织特异性基因的miRNAs研究很少，参与调节牙周膜细胞成骨分化特异性基因的miRNAs差异表达及功能调节作用的研究国内外尚未见报道。特别是有关miRNAs在转录后水平对牙周膜相关特异性基因PLAP-1的表达调节及特异性基因PLAP-1的miRNAs调节对牙周膜细胞增殖和成骨分化功能作用的影响研究，目前国内外均尚未见报道。miRNAs是否在牙周膜细胞骨向分化中发挥着不可或缺的作用？对牙周膜细胞特异性基因的功能调控如何？对于这些问题的探索和回答都是崭新的前沿研究领域。因此，本论文旨在研究参与靶向调节PLAP-1基因表达的miRNAs以及其对靶基因PLAP-1的调节作用在人牙周膜细胞增殖和牙周膜细胞骨向分化中功能调节作用的影响。
本论文主要包括以下四章内容:
第一章:PLAP-1基因在人牙周膜细胞及其骨向分化中的表达
目的:建立体外培养人牙周膜细胞及其骨化诱导研究模型，观察和验证体外培养人牙周膜细胞及其骨向分化诱导中PLAP-1基因表达。
方法:本研究采用体外酶消化法培养人牙周膜细胞并进行间充质来源细胞表面标记检测，用MTT法、茜素红及VonKossa染色、免疫组化、ALP、RT-PCR和Westernblot等方法进行检测牙周膜细胞增殖及PLAP-1基因在人牙周膜细胞及其骨向分化诱导中的表达模式。
结果:本实验成功培养人牙周膜细胞模型并成功进行牙周膜细胞骨向分化诱导，细胞增殖和矿化状态良好，检测PLAP-1基因在人牙周膜细胞中大量分布，主要分布在细胞核周围的细胞浆中，胞浆末端很少，PLAP-1基因在牙周膜细胞中及其骨向分化诱导进行中持续表达并随矿化时间的进行呈逐渐增加趋势。
结论:研究结果表明本实验培养的牙周膜细胞模型保持了间充质来源细胞群牙周膜细胞原有的特性，细胞增殖状态良好，经矿化诱导能够向成骨方向分化并在分化中表现牙周膜特异性基因PLAP-1的正常表达，为进一步研究PLAP-1基因在人牙周膜细胞及其骨向分化诱导中的表达变化和分子调节机制提供细胞模型实验基础。
第二章:miRNAs靶向调控PLAP-1基因表达的筛选和验证
目的:筛选和验证靶向调控牙周膜特异性基因PLAP-1表达的miRNAs，验证检测在人牙周膜细胞骨向分化中PLAP-1基因和靶向调控PLAP-1基因表达的miRNAs的表达趋势及PLAP-1与靶miRNAs在牙周膜细胞成骨分化中表达趋势的关联性。
方法:首先利用Targetscan、miRBase、microRNA.org和miRGen-miRanda等生物学软件和数据库对潜在靶向PLAP-1基因的miRNAs进行预测分析，然后取四个软件共同交集靶位点的miRNAs作为研究对象，结果得到307种miRNAs具有潜在靶向调节PLAP-1基因的能力，其中有5种为共同交集预测miRNAs极具潜在靶向能力的重要信息作为深入研究对象。为进一步筛选验证在牙周膜细胞中能够靶向调节PLAP-1基因miRNAs，采用双荧光素酶报告基因分析系统和定量RT-PCR方法对靶向调节PLAP-1基因的miRNAs进行筛选验证并采用定量RT-PCR方法检测PLAP-1基因和靶miRNAs在人牙周膜细胞骨向分化中表达变化趋势，采用定量RT-PCR和Westernblot等方法验证PLAP-1基因和蛋白和靶miRNAs表达趋势与人牙周膜细胞成骨分化中表达量变化趋势的关联性。
结果:Targetscan、miRBase、microRNA.org和miRGen-miRanda四个软件交集靶位点的miRNAs作为研究对象，结果显示miR144、miR26a、miR26b、miR21和miR101共5种miRNAs为极具潜在靶向调节PLAP-1基因能力miRNAs。双荧光素酶报告系统分析结果显示加入PLAP-1基因后各组的荧光素酶活性具有显著差异(F=11.050，P＜0.001)，采用LSD的多重比较方法表明，psiPLAP-1+miR21的荧光素酶活性分别与psiPLAP+Blank、psiPLAP+miR26a、psiPLAP+miR26b、psiPLAP+miR144比较均有下降，且差异具有统计学意义(P＜0.05)，psiPLAP-1+miR101的荧光素酶活性分别与psiPLAP+Blank、psiPLAP+miR26a、psiPLAP+miR26b、psiPLAP+miR144比较均有下降，且差异具有统计学意义(P＜0.05)，但是psiPLAP-1+miR26a、psiPLAP-1+miR26b及psiPLAP-1+miR144分别与psiPLAP-1+Blank组进行两两比较均无显著差异(P＞0.05)，说明miR21和miR101能够靶向结合PLAP-13'UTR从而抑制荧光素酶的活性，可进行后续深入研究。PLAP-1基因在人牙周膜细胞骨向分化过程中随矿化时间增加，其定量RT-PCR的表达量不断增长变化差异具有统计学意义(F=291.982，P＜0.001)。而靶向调节PLAP-1基因的miR21或miR101在人牙周膜细胞骨向分化过程中随矿化时间增加其定量RT-PCR的表达量不断减少且不同时间点之间的表达量变化差异具有统计学意义，有显著差异(F=181.266，P＜0.001;F=40.233，P＜0.001)。在牙周膜细胞中瞬转过表达miR21或miR101时PLAP-1基因表达变化差异明显(F=120.691，P=0.001)，其中加入miR21或miR101后，PLAP-1基因的表达量相比起正常细胞显著减少(P=0.012，P=0.002)，变化趋势相反。
结论:miR21和miR101能够结合PLAP-13'UTR靶向调节PLAP-1基因表达，而miR26a，miR26b和miR144则不能。miR21及miR101表达量变化和靶基因PLAP-1在人牙周膜细胞骨向分化过程中表达量变化分别呈负相关变化趋势。过表达miR21或miR101均可抑制靶基因PLAP-1表达。因此从5个候选miRNAs中筛选和鉴定出靶向PLAP-1基因的miRNAs（miR21、miR101）做后续进一步深入研究和分析。
第三章:miR21/miR101靶向调节PLAP-1基因的结合位点分析
目的:分析miR21/miR101靶向调节PLAP-1基因的结合位点。
方法:采用MicroRNA.org软件结分析及预测miR21或miR101靶向调节PLAP-1基因的结合位点。用双荧光素酶报告基因分析系统和定量RT-PCR方法分析miR21或miR101与靶基因PLAP-1的结合位点，然后对结合位点进行定点突变并进行验证结合位点分析。
结果:用MicroRNA.org软件分析预测获得miR21或miR101靶向调节PLAP-1基因的结合位点后，采用双荧光素酶报告基因系统分析，结果显示在转染克隆有psiPLAP-13'UTR质粒的多组间的荧光素酶活性差异进行比较具有显著差异(F=881.425,P＜0.001)，其中psiPLAP-13'UTR+Blank与psiPLAP-13'UTR+NC之间没有显著差异(P＞0.05)，但psiPLAP-13'UTR+miR21、psiPLAP-13'UTR+miR101分别与psiPLAP-13'UTR+NC比较荧光素酶活性均有下降，且具有显著差异(P=0.008和P＜0.001),psiPLAP-13'UTR+miR21与psiPLAP-13'UTR+miR101相比也有显著差异(P＜0.05)，这表明psiPLAP-13'UTR质粒与miR21或miR101结合能够抑制双荧光素酶活性。另外，在转染克隆有结合位点定点突变mutpsiPLAP-13'UTR质粒+miR21或miR101的实验组中，其荧光素酶活性与psiPLAP-13'UTR+Blank、psiPLAP-13'UTR+NC组比较均无统计学差异(P＞0.05)，结果表明结合位点定点突变后mutpsiPLAP-13'UTR质粒不能与miR21或miR101结合，即PLAP-13'UTR与miR21和miR101的结合位点突变完全，从而不能影响双荧光素酶活性的变化。
结论:经分析和验证确定miR21和miR101靶向调节PLAP-1基因的结合位点为miR101与靶基因PLAP-13'UTR结合位点为338-345位点7个碱基（gtactgt）、miR21与靶基因PLAP-13'UTR结合位点为748-755位点7个碱基(ataagct)。根据本章所得结果选择抑制荧光素酶活性较强、调节PLAP-1基因表达量变化较显著的has-mir-101作为进一步研究对象，探讨其与PLAP-1靶基因之间的功能调节作用，并深入研究miR101对PLAP-1靶基因的调节对人牙周膜细胞增殖和骨向分化等功能作用的调节影响。
第四章:miR101靶向调节PLAP-1基因的功能研究
目的:研究miR101靶向调节PLAP-1基因对牙周膜细胞成骨分化中细胞增殖和骨化功能的影响。
方法:首先获得miR101过表达和表达抑制的慢病毒，进行预实验测定慢病毒稳定感染牙周膜细胞的MOI值，依此对牙周膜细胞进行稳定转染miR101过表达和表达抑制慢病毒，研究稳定转染miR101过表达和表达抑制慢病毒载体后人牙周膜细胞增殖和骨向分化诱导过程中miR101对PLAP-1基因靶向调节对人牙周膜细胞增殖和骨向分化功能的影响。采用MTT法检测细胞增殖周期，诱导牙周膜细胞骨向分化过程中用茜素红染色观察矿化结节形成能力并用酶活性检测法检测ALP活性变化，采用定量RT-PCR和Westernblot方法检测人牙周膜细胞骨向分化过程中靶基因PLAP-1基因和蛋白表达量变化并进行比较。
结果:MTT法检测牙周膜细胞增殖数据分析结果显示，时间和分组的主效应、时间和分组的交互效应均具有统计学差异(F=1340.419，P＜0.001;F=703.856，P＜0.001;F=201.765，P＜0.001)。空载组和miR101组在四个时间点具有相似的增长趋势，但是anti-miR101组的增长趋势较前两者缓慢。在剔除了时间因素的影响下，mir101组和空载组中MTT的OD值较anti-miR101组上调，且差异有统计学意义(P值均小于0.001)。在剔除了分组因素的影响下，四个时间点下MTT的OD值均呈上升的趋势，且两两比较差异都具有统计学意义（P值均小于0.001）。在固定第七天时，三组之间的两两比较均有显著差异(P值均小于0.001)。结果表明过表达miR101增强牙周膜细胞骨化过程中的细胞增殖，抑制表达anti-miR101抑制牙周膜细胞骨化过程中的细胞增殖。
ALP活性测定数据分析结果显示时间和分组的主效应(F=190.901，P＜0.001;F=137.811，P＜0.001)、时间和分组的交互效应均具有统计学差异(F=47.362,P＜0.001)，其中以anti-miR101组在第0天时的ALP活性最低，而miR101组在第21天时ALP活性最高。在剔除了时间因素的影响下，三组中每两组的ALP活性值具有显著差异，其中空载组和anti-miR101组中细胞ALP活性较miR101组均有下调（P值均小于0.001）。在剔除了分组因素的影响下，四个时间点中每两个时间点的ALP活性值均有显著差异(P值均小于0.001），ALP活性值随着时间逐渐上调。结果表明过表达miR101增强牙周膜细胞骨化过程中的钙盐沉积，抑制表达anti-miR101抑制牙周膜细胞骨化过程中的钙盐沉积。
PLAP-1基因表达的定量RT-PCR测定数据结果分析显示，时间和分组分别作为主效应均具有显著差异(F=6.400，=0.008;F=48.994，P＜0.001)，时间和分组之间具有交互作用，也具有统计学差异(F=6.180，P=0.003)。其中miR101在第21天时定量PCR的表达量最低。空载组随着时间的变化，定量RT-PCR的值逐渐上调，而miR101组恰好相反，anti-miR101组定量RT-PCR检测表达量在第7和第14天与miR101基本一致，但在第21天时比miR101组上调。在剔除了时间因素的影响下，miR101组和anti-miR101组中定量RT-PCR检测表达量较空载组均有下调，且差异有统计学意义(P值均小于0.001)。在剔除了分组因素的影响下，第14天、第21天三组的表达量较第7天均上调，且差异具有统计学意义(分别为P=0.025和P=0.003)。空载组与miR101在第7天、第14天和第21天的定量PCR值均有显著差异(P值均小于0.001)，结果说明miR101过表达抑制了PLAP-1基因表达量，而anti-miR101抑制表达后增加了靶基因PLAP-1表达量。
矿化结节形成染色观察和Westernblot法蛋白检测结果显示，与空载组比较miR101过表达组矿化结节形成数量和PLAP-1蛋白表达均呈增加变化趋势;而与空载组比较anti-miR101抑制表达组矿化结节形成数量和PLAP-1蛋白表达均呈减少变化趋势。
结论:研究结果显示miR101过表达后抑制了靶基因PLAP-1表达，减弱了PLAP-1基因对牙周膜细胞骨向分化的负调节作用，增强了牙周膜细胞的增殖和矿化能力，而anti-miR101表达抑制后增加了PLAP-1基因表达，增强PLAP-1基因对牙周膜细胞骨向分化的负向调节作用，减弱了牙周膜细胞增殖和矿化能力。
非编码单链RNA 分子;PLAP-1基因;成骨分化;双荧光素酶报告系统;牙周膜细胞
南方医科大学
博士
外科学
吴补领
2012
中文
R781.4
163
2013-04-26（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）