伞枝犁头霉Absidia corymbifera AS2生物转化富集黄芪甲苷研究
黄芪甲苷(ASI)是中药黄芪中一种具有多种药理活性的皂苷类化合物，为黄芪制剂质量鉴定的指标成分。黄芪甲苷生物活性突出，中药一类新药“黄芪甲苷葡萄糖注射液”作为治疗缺血性心肌炎的药物正在进行Ⅲ期临床研究。但由于黄芪甲苷结构复杂，无法进行化学全合成，因此其来源主要依靠从黄芪植物中提取。而其在黄芪中含量又非常低，需要大量植物资源和有机溶剂，使大规模制备成为瓶颈。
微生物转化反应具有专一性强、污染少和转化率高的优点，广泛用于天然产物的结构改造。本研究在国家重大科技专项(2009ZX09301-011)的资助下，借鉴前人的研究经验，采用微生物转化富集技术，以黄芪总皂苷作为底物，通过发酵转化提高黄芪甲苷含量。主要内容是从筛选菌种开始，建立了发酵转化和从发酵液中分离提取黄芪甲苷的新方法，并成功分离获得新的关键酶-黄芪皂苷去乙酰化酶。此外，通过对可转化为黄芪甲苷的前体化合物的鉴定和转化研究，假设了一条全新的微生物去乙酰化富集黄芪甲苷的途径。具体研究结果如下：
1、本研究首先从不同来源的霉菌中筛选到能够高效转化黄芪总皂苷生成黄芪甲苷的菌种--Absidia corymbifera AS2。以黄芪总皂苷为底物，在投料浓度为5g/L的情况下，转化60 h，转化率最高达到90.3％，黄芪甲苷的含量是原料中的3倍。产物黄芪甲苷主要集中在发酵上清液中，经D101大孔吸附树脂分离纯化后，总回收率最高达到了62％，产品色谱纯度达到95％以上。该发酵及纯化工艺黄芪甲苷收率高，成本低，操作简便，避免使用有机溶剂，有利于其工业化生产。
2、本研究对黄芪总皂苷中可能转化为黄芪甲苷的前体化合物进行了分析。采用常规硅胶柱和反相硅胶柱分离的方法，并以A.corymbifera AS2微生物转化为指导，进行前体化合物的分离和确认，最终共分离到4个可转化为黄芪甲苷的皂苷类化合物。经结构鉴定4个前体化合物分别是astragalosideⅠ(AS-Ⅰ)，isoastragalosideⅠ(isoAS-Ⅰ)，astragalosideⅡ(AS-Ⅱ)和isoastragalosideⅡ(isoAS-Ⅱ)。通过ELSD检测与DAD扫描相结合的方法对四个前体化合物进行纯度鉴定，并采用ELSD吸收图谱的归一化法对四个标准品的纯度进行标定，结果分别为AS-Ⅰ(97％)、isoAS-Ⅰ(97.4％)、AS-Ⅱ(98％)和isoAS-Ⅱ(98.7％)。建立了黄芪甲苷和4个前体化合物HPLC分析方法和标准曲线，通过对发酵转化以及酶转化过程的实时分析，进行代谢途径的研究。
3、从化学结构分析来看，AS-Ⅰ(2'3'-di-OAc)和isoAS-Ⅰ(2'4'-di-OAc)比黄芪甲苷多两个乙酰基；AS-Ⅱ(2'-OAc)和isoAS-Ⅱ(3'-OAc)比黄芪甲苷多一个乙酰基。这些结构均可完全被A.corymbifera AS2转化为黄芪甲苷，提示该菌株可能存在去乙酰化酶。为了进一步研究微生物转化黄芪总皂苷生成黄芪甲苷的机制，本研究继续对该微生物中可能存在的去乙酰化酶进行分离纯化。首先采用硫酸铵分步沉淀法浓缩粗酶液中的目标蛋白，再进行Q-sepharose HP离子交换层析，在0.1 mol/L氯化钠洗脱组份中发现了较高的酶活性。该组份经phenyl-sepharose6 FF疏水层析，收集在0.7 mol/L硫酸铵洗脱的活性组份继续进行CHT陶瓷型羟基磷灰石柱层析，在24.5 mmol/L磷酸钾洗脱组份中发现有较高的活性。最后采用1 mL Resource Q预装柱层析获得电泳纯的活性蛋白。酶活力回收率和蛋白回收率分别为0.32％和0.075‰。
4、进一步对分离获得的黄芪皂苷去乙酰化酶进行酶学性质研究。以p-NPA为底物在pH7.0和30℃条件下的动力学常数：米氏常数Km值为3.76 mmol/L；最大反应速率Vmax为17.64 mmol/min/mg。以p-NPA为底物的最适反应pH为8.0，在pH7.0-9.5范围内稳定；最适反应温度为35-45℃；在小于45℃温度范围内相对稳定。MS检测分子量为36067 Da。采用SPITC修饰的PSD-MALDI质谱进行序列分析，显示该酶可能为之前没有报道过的新酶。
5、最后对黄芪皂苷去乙酰化酶的酶解途径进行研究。结果显示4个前体化合物的转化途径分别是：AS-Ⅱ→ASI；isoAS-Ⅱ→AS-Ⅱ→ASI：AS-Ⅰ→(AS-Ⅱ、isoAS-Ⅱ)→ASI：isoAS-Ⅰ→AS-Ⅱ→ASI。
微生物转化;黄芪甲苷;柱层析;去乙酰化酶;伞枝犁头霉
复旦大学
博士
药物化学
周珮
2012
中文
R284
124
2013-04-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）