KLK5在乳腺癌中的表达及其靶向microRNA的预测和验证
目的：人组织激肽释放酶基因家族(Kallikreins，KLKs)属于丝氨酸蛋白酶家族，是近年来新发现的肿瘤标志物家族，在许多恶性肿瘤中都有异常的表达。KLK5是KLKs的一个成员，人们对KLK5在乳腺癌中的表达情况的意见还存在分歧，且包括KLK5在内的KLKs表达的调节机制尚未明确，我们通过本实验欲达到以下三个目的：首先，探讨KLK5在乳腺癌当中的表达情况；其次，寻找与KLK53’-UTR存在靶作用关系的microRNA，探讨乳腺癌中KLK5表达的调节机制；第三，探讨与KLK5mRNA3’-UTR存在靶作用的microRNA在乳腺癌细胞增殖和迁移方面的作用。
方法：⑴应用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、蛋白印迹(western-blot)对乳腺癌组织及其癌旁组织、乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231中KLK5表达进行检测。⑵应用生物信息学方法，结合相关文献报道和其在乳腺癌细胞中表达情况对与KLK5mRNA3’-非翻译区(UTR)有靶作用关系的microRNA进行初步筛选，然后应用转染相应microRNA后检测KLK5的方法和共转染含KLK5mRNA3’-UTR的双荧光素酶报告基因连同该microRNA后检测相对荧光强度变化的方法对筛选出的microRNA进行靶标验证。⑶应用流式细胞术和细胞划痕实验检测与KLK53’-UTR靶作用的microRNA对乳腺癌细胞增殖和迁移能力的影响。
结果：①KLK5在乳腺癌组织中表达低于癌旁组织，局部晚期癌中表达低于早期浸润癌，恶性程度高的乳腺癌细胞系MDA-MB-231中表达低于恶性程度低的MCF-7。②生物信息学方法筛选出十种与KLK5mRNA3’-UTR可能存在靶作用的microRNA并检测其在MCF-7和MDA-MB-231中的表达，结果显示只有miR-125b在MCF-7中表达低于MDA-MB-231，与KLK5在两种细胞系中的表达情况相反；过表达miR-125b后可降低乳腺癌细胞中KLK5水平；共转染miR-125b和pmir-KLK5后可引起荧光强度的降低，但是对照组无此现象。③MCF-7细胞中过表达miR-125b可以使处于G1期的细胞比例增高，同时减弱细胞的划痕修复能力。
结论：⑴KLK5在乳腺癌癌组织和癌旁组织中表达存在差异且与肿瘤临床分期及恶性程度有关，可作为判断乳腺癌进展的生物学指标。⑵miR-125b在MDA-MB-231中表达高于MCF-7，且经生物信息学预测和靶标验证实验证实miR-125b能够靶作用于KLK5mRNA3’-UTR抑制KLK5的表达。⑶miR-125b可以抑制MCF-7的增殖和迁移能力，可作为乳腺癌基因治疗的靶点。
乳腺肿瘤;丝氨酸蛋白酶;基因表达;病理细胞学
泰山医学院
硕士
免疫学
胡成进
2012
中文
R737.9;R730.21
63
2013-04-26（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）