脑内嗅鞘细胞移植对mSOD1G93A ALS大鼠治疗作用的研究
目的：观察荧光大鼠嗅球来源的嗅鞘细胞经颅移植到放射冠后对mSOD1G93A转基因ALS大鼠的发病时间、生存率、行为学等方面的影响，探讨嗅鞘细胞经颅移植到放射冠对mSOD1G93A转基因ALS大鼠的治疗作用及相关机制，为临床ALS治疗提供相关的实验学证据。
方法：⑴出生21天的仔鼠剪鼠尾适量，DNA提取后PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后在凝胶成像系统下观察。⑵新生1周的SD大鼠，荧光显微镜下观察，筛选出荧光表现阳性的大鼠备用，先用碘伏消毒其全身，尤其是头颈部，再用酒精喷洒脱碘后拿到超净工作台内，用消毒剪沿颈部剪下，换剪刀后沿头顶正中线剪开皮肤和颅骨，取出双侧嗅球，放于冰块上的DF-12内，清洗三遍，解剖镜下剥膜，头部难剥离部分可适当保留，用眼科剪剪成1立方毫米大小的组织块，将剪碎的组织块移入15ml离心管，用弯头吸管来回轻轻吹打，制成细胞悬液，胰蛋白酶消化后收集细胞，以13％的血清培养基制成细胞悬液平均铺入经多聚赖氨酸包板后的细胞培养板中，在CO2培养箱中培养。⑶包括形态学鉴定和免疫荧光染色鉴定，形态学鉴定可在倒置显微镜下观察细胞的形态，类似小蝌蚪样，胞体呈球形或星形，周围有突起。Hoechst标记细胞核，同时用P75NGFR和S-100染色进行免疫荧光鉴定，激光共聚焦显微镜下观察，染色双阳性细胞与总细胞数量相比即得到嗅鞘细胞的纯度。⑷嗅鞘细胞移植所用仪器是立体定位仪，对象是90日龄野生型大鼠和mSOD1G93A转基因大鼠。大鼠4％水合氯醛麻醉后，俯卧于手术台上，用立体定位仪固定，去掉大鼠头部的毛发，在颅骨距离前囟2毫米，中线右侧1.5毫米的位置开一个直径大约5毫米的孔，玻璃微注射器插入到放射冠(距离表面2.75毫米)。将5微升的细胞悬液(约个5×105嗅鞘细胞)或者是DF12在十分钟之内缓慢的注射到孔内。手术过程中不使用环胞霉素，而在术后所有动物连续三天按每天每千克体重10毫克的量皮下注射青霉素预防感染。⑸所有实验动物自出生后90天起进行发病时间、生存时间、体重及相应行为学实验的观察。⑹所有实验动物分别于细胞移植后5周(125天)及7周(139天)取大脑皮层和腰段脊髓进行组织学检测。细胞移植后五周取材的脊髓做冠状切片的尼氏染色，计算各组的神经元数量。显微镜下观察运动神经元，记录细胞形态完整的运动神经元细胞数量。⑺细胞移植后五周和七周取材的冰冻切片做ChAT蛋白的免疫组织化学染色。冰冻切片机切片后将片子放到37度烤箱内烤30分钟，进行防脱片处理，放到摇床上用PBS洗三遍，血清孵育2h后加入一抗过夜，复温后再洗三遍，加入二抗室温孵育1小时，Hoechst进行细胞核染色，封片保存待观察。⑻处死大鼠后快速取所需要的组织并提取蛋白，测定浓度后进行琼脂糖凝胶电泳，将电泳产物进行硝酸纤维素转膜，产物进行封闭杂交，暗室内曝光，凝胶图像分析仪扫描得到的图像，Quantity One软件分析条带光密度。
结果：①嗅鞘细胞移植到SOD1G93A转基因大鼠放射冠两周后，荧光显微镜下观察表达绿荧光蛋白的嗅鞘细胞在移植大鼠的放射冠移植点周围弥散分布。移植后5周，弥散到更远的地方，移植后7周，逐渐消失，但仍有少量存活。②各组大鼠的四肢出现异常的平均时间均为125天左右，即各组发病时间没有统计学意义。而嗅鞘细胞移植组的生存时间和疾病过程中的各项指标均明显好于其他几组，即细胞移植延长了大鼠的生存时间，改善了发病到死亡过程中大鼠的各项生理指标。③大脑皮层和腰段脊髓的前角运动神经元尼氏染色显示，SOD1G93A转基因大鼠发病后出现运动神经元的大量死亡，并有统计学差异(p<0.001)。OEC移植组SOD1G93A转基因大鼠的运动神经死亡的数量远少于其他两组。ChAT的免疫组织化学染色结果与尼氏染色结果一致。④野生的阳性对照组大鼠的ChAT蛋白水平远高于嗅鞘细胞移植组，但细胞移植组又高于未经治疗的其他两组，并均有统计学差异。而培养基注射组和SOD1G93A组的ChAT蛋白水平无统计学差异(p<0.01)。
结论：嗅鞘细胞移植可以延缓SOD1G93A转基因大鼠的发病时间，改善发病后大鼠的运动功能，并使其生存时间相应延长，移植后的嗅鞘细胞可以在大鼠体内存活至少7周，同时还可以抑制大脑皮层及脊髓运动神经元的的死亡。
肌萎缩症;神经修复;嗅鞘细胞;细胞移植
泰山医学院
硕士
神经生物学
黄红云;段耀奎
2011
中文
R746.05;R457.7
56
2013-04-26（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）