蜂胶黄酮对CD44CD25+调节性T细胞的影响及与动脉粥样硬化的关系
既往研究表明蜂胶黄酮具有确切的抗动脉粥样硬化功能，其作用机制也有较为详细的研究，但仍不明确。已知CD4+CD25+调节性T细胞对动脉粥样硬化具有抑制作用，蜂胶黄酮是否通过影响CD4+CD25+调节性T细胞的数量和/或功能从而发挥抗动脉粥样硬化的作用，目前尚未见报道。本研究通过实验动物模型探讨蜂胶黄酮对CD4+CD25+调节性T细胞及动脉粥样硬化的影响。
目的：⑴探讨验证蜂胶黄酮与血脂、NO、NOS、ET、VEGF等指标的关系；⑵进一步验证蜂胶黄酾的抗动脉粥样硬化作用；⑶明确蜂胶黄酮是否通过影响CD4+CD25+调节性T细胞的数量和/或功能，从而发挥抗动脉粥样硬化作用。
方法：用超声波辅助乙醇提取法提取蜂胶黄酮，采用硅胶柱层析纯化蜂胶总黄酮，分光光度计法鉴定蜂胶黄酮纯度。利用7-8周龄雄性ApoE-/-小鼠建立动脉粥样硬模型，随机分为4组，每组10只。分别为：①高脂组(HL组)：高脂饲料饲养；②正常对照组(NC组)：普通饲料饲养；③高脂+蜂胶黄酮组(HP)：高脂饲料饲养并且给予蜂胶黄酮300mg.kg-1.d-1；④蜂胶黄酮组(PF组)：普通饲料饲养并给予蜂胶黄酮300mg.kg-1.d-1。连续灌胃给药14周，内眦静脉取血，离心获得血清，然后采用生化分析仪检测其中甘油三脂(TG)、胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)和极低密度脂蛋白(VLDL)浓度；硝酸还原酶法检测血清一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)浓度；酶联免疫双抗体夹心法(ELISA)检测血清内皮素(ET)和血管内皮生长因子(VEGF)浓度；取小鼠整条动脉，进行油红O染色分析整条主动脉AS斑块面积占整条主动脉面积的比例；取小鼠脾脏研磨、过滤获得脾细胞后进行原代细胞培养，培养24小时后进行流式细胞术检测CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞占CD4+T细胞比例；从小鼠脾脏细胞提取mRNA以RT-PCR法检测Foxp3mRNA表达。
结果：⑴血液TG浓度HL组、HP组、NC组和PF组依次降低，分别是：HL组16.04±1.41mmol/L，HP组13.97±1.34mmol/L、NC组10.00±1.51mmol/L，PF组6.92±1.04mmol/L。方差分析表明HL组、HP组、NC组TG浓度显著高于PF组，差异均有统计学意义(P均<0.05)。同样，血液LDL浓度HL组、HP组、NC组和PF组亦逐渐降低，分别是：HL组11.05±1.81mmol/L，HP组8.82±0.91mmol/L，NC组7.38±1.04mmol/L，PF组6.16±0.96mmol/L。方差分析表明HL组、HP组、NC组LDL浓度显著高于PF组，差异均有统计学意义(P<0.05)。⑵PF组、NC组、HP组、HL组血清NO浓度依次降低，分别为87.40±6.56umol/L、80.38±6.75umol/L、80.18±7.13umol/L、71.64±6.13umol/L。方差分析表明HL组、HP组、NC组TG浓度显著低于PF组，差异均有统计学意义(P均<0.05)。⑶PF组血清TNOS浓度(20.14±5.99U/mL)显著低于HL组(45.48±7.38U/mL)、HP组(40.32±5.91U/mL)、NC组(36.70±5.70U/mL)，差异有统计学意义(P均<0.05)。PF组血清iNOS浓度(15.06±3.34U/mL)显著低于HL组(39.11±5.25)、HP组(34.49±2.80U/mL)和NC组(31.66±2.73U/mL)，方差分析表明差异均有统计学意义(P均<0.05)。HL组血清TNOS、iNOS水平均显著高于NC组，差异均有统计学意义(P<0.05)，HP组与NC组间血清TNOS、iNOS差异均无统计学意义(P>0.05)。⑷方差分析表明，PF组血清ET浓度显著低于HL组(57.04±6.20ng/Lvs82.194±6.85ng/L)，NC组(73.42±6.21ng/L)和HP组(78.42±5.81ng/L)，差异有统计学意义(P<0.05)。HP组和NC组血清ET差异无统计学意义(P>0.05)。NC组低于HL组，差异有统计学意义(P<0.05)。⑸PF组动脉粥样硬化面积/整条动脉面积显著低于HL组(0.20±0.06ratio vs0.44±0.05ratio)，也显著低于PF组(0.38±0.06ratio)和NC组(0.35±0.07ratio)差异有统计学意义(P<0.05)；HP组和NC组之间差异无统计学意义(P>0.05)；HP组和NC组动脉粥样硬化面积/整条动脉面积显著低于HL组，差异有统计学意义(P<0.05)。⑹PF组血清VEGF浓度显著低于HL组(78.90±13.13ng/Lvs155.62±23.96ng/L)，也显著低于NC组(123.28±16.83ng/L)和HP组(135.85±15.65ng/L)，方差分析表明，差异有统计学意义(P<0.05)。HL组高于NC组，差异有统计学意义(P<0.05)。HP组和NC组血清ET之间差异无统计学意义(P>0.05)。⑺方差分析表明，PF组的CD4+CD25+Foxp3+Treg比例(5.55±0.77％)显著高于HL组(2.79±0.67％)也高于HP组(4.31±0.69％)，差异均有统计学意义(P<0.05)。HP组低于NC组，差异有统计学意义(P<0.05)。PF组和NC组(5.49±0.91％)比较差异无统计学意义(P>0.05)。⑻方差分析表明PF组Foxp3mRNA表达水平显著高于HL组(1.50±0.66copies/ul vs0.77±0.37copies/ul)也高于HP组(1.38±0.23copies/ul)和NC组(1.43±0.13copies/ul)，差异有统计学意义(P<0.05)。HP组与NC组之间差异无统计学意义(P>0.05)(详见表12)HL组Foxp3mRNA表达水平低于NC组，差异有统计学意义(P<0.05)。
结论：①蜂胶黄酮可以降低ApoE-/-小鼠血清TG、TC、LDL、VLDL浓度；升高小鼠血清NO浓度，降低血清iNOS和ET浓度；②蜂胶黄酮可以抑制ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化发展，降低血清中VEGF的水平；③蜂胶黄酮能够提高ApoE-/-小鼠CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的比例和Foxp3mRNA表达水平，提示蜂胶黄酮通过CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞发挥抗动脉粥样硬化作用。
动脉粥样硬化;调节性T细胞;蜂胶黄酮;细胞病理学
泰山医学院
硕士
内科学
李秀昌
2012
中文
R541.402
61
2013-04-26（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）