新型隐球菌抗-CAP10蛋白单克隆抗体制备及临床感染检测研究
近年来，新型隐球菌感染不断增多，由其引起的隐球菌性脑膜炎也成为临床脑膜炎的重要病原。新型隐球菌致病力主要由其细胞壁的多糖荚膜所介导，其中荚膜相关蛋白是荚膜形成的必须组分，在新型隐球菌感染的诊断和治疗中具有重要作用，但目前对新型隐球菌致病机制及感染诊断仍然缺乏系统深入的研究。目前报道有四种与新型隐球菌致病相关的荚膜相关蛋白，其中的CAP10蛋白，是继CAP59、CAP60、CAP64后于近年研究报道，目前未见针对该蛋白的免疫诊断和感染检测的研究报道。本研究针对新型隐球菌荚膜相关蛋白CAP10制备了特异性抗-CAP10的单克隆抗体，为临床新型隐球菌的检测和血清型分析奠定了基础：同时对检测新型隐球菌感染的两种免疫学检测方法在临床诊断中的应用进行了比较分析，为临床新型隐球菌感染的免疫学检测提供重要的参考数据。
1.新型隐球菌CAP10蛋白的重组表达及单克隆抗体制备：
①新型隐球菌CAP10蛋白的重组表达：采用生物信息技术对荚膜相关蛋白CAP10进行抗原表位预测分析。分析结果发现，该蛋白S1区段(70-215aa片段)在隐球菌病主要致病菌(血清型A、D、AD)中保守性最高，S2区段(350-510aa片段)只识别格特隐球菌和部分新生隐球菌。为了在原核表达系统中进行有效表达，采用密码子优化技术优化并合成了上述2个区段基因，克隆至原核表达载体pQE30中。转化表达宿主菌后经诱导，成功表达出荚膜相关蛋白CAP10-1(70-215aa)重组蛋白。该重组蛋白分子量约为25kD，重组蛋白以包涵体形式表达，经纯化后获得目的重组蛋白。
②抗-CAP10蛋白的单克隆抗体制备及鉴定：用纯化的重组蛋白CAP10免疫Balb/c小鼠，经过2次免疫，血清抗体效价达到适当水平时进行细胞融合；经有限稀释进行亚克隆和筛选后，得到11株分泌抗-CAP10的单克隆抗体细胞株。腹水中11株单抗效价大于1:50万。对11株获得的单克隆抗体通过ELISA检测其特异性。将重组表达的CAP10-2(350-510aa)重组蛋白用作对照蛋白，同时再分别以大肠杆菌裂解蛋白和购买的荚膜相关蛋白CAP59蛋白为对照抗原进行包被，采用间接ELISA法检测制备的单克隆抗体。上述抗体只与CAP10-1重组蛋白反应；与荚膜相关蛋白CAP10的另一区段表达的重组蛋白CAP10-2不反应，与其它蛋白也无交叉反应。实验表明，制备的上述单克隆抗体是针对荚膜相关蛋白CAP10的特异性单抗。抗-CAP10单抗的成功制备为临床新型隐球菌的检测和血清型的分析奠定了基础。
2.新型隐球菌检测方法的比较及在临床检测中的应用：经病原分离培养后，以墨汁染色方法检测阳性的病例作为诊断标准，采用胶体金和乳胶凝集方法对40例脑膜炎脑脊液标本进行检测，分别比较两血清学方法检测新型隐球菌的敏感度和特异性。与墨汁染色方法比较，胶体金和乳胶凝集方法检测脑膜炎脑脊液标本原液时，其特异性分别为58.3％(14/24)和66.7%(16/24)。都存在一定假阳性，假阳性率分别为41.7%(10/24)和33.3%(8/24)。将临床标本进行20倍稀释后进行检测以降低假阳性率。检测结果表明，与墨汁染色方法比较，胶体金方法和乳胶凝集方法敏感性达到87.5%(14/16)，特异性为95.8%(23/24)，两种方法的特异性显著提高。在经临床和实验诊断确诊的14例结核性脑膜炎标本进行检测中发现，标本为原液时，用胶体金试剂检测呈现出6例阳性，其中4例乳胶凝集方法检测结果阳性，假阳性率高。采用标本稀释后进行检测则消除了假阳性。结果表明，乳胶凝集和胶体金检测方法可有效应用于临床结核性脑膜炎的鉴别诊断。本研究结果表明在临床检测时应进行检测标本的稀释，以降低假阳性从而避免误诊，并结合其它检测方法进行诊断，这也是目前临床检测中被忽视的技术环节。
新型隐球菌;CAP10重组蛋白;单克隆抗体;免疫检测;脑膜炎;鉴别诊断
温州医科大学;温州医学院
硕士
临床检验诊断学
高基民;周育森
2012
中文
R515.2;R446.62
51
2013-04-26（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）