E3连接酶SIAH及其与PHC2和EEF1D蛋白的相互作用研究
本论文的工作是关于人E3泛素连接酶SIAH-1b(下简称SIAH)及其相互作用蛋白的研究。我们通过酵母双杂交技术以SIAH作为诱饵蛋白,在人胎肝文库中筛选到两个新的相互作用的蛋白:PHC2和EEF1D。围绕这两个蛋白质与SIAH的关系,我们开展了两部分工作:第一部分是关于SIAH降解PHC2的研究;第二部分是关于EEF1D调控SIAH的E3连接酶活性的研究。 E3连接酶SIAH与果蝇SIAN(seven-in-absentia),同源,可识别底物蛋白并使其经泛素-蛋白酶系统降解。SIAH在细胞周期调控、肿瘤发生和神经退行性病变等生理学过程都发挥了作用。 在第一部分中,我们发现SIAH可结合PHC2并通过泛素化-蛋白酶体途径将其降解。 PHC2(polyhomeotic homolog 2)是PeG基因群中的一员。PeG基因群编码一类蛋白,形成多聚复合物结合到染色质上,稳定地抑制一些发育必须基因(如Hox基因簇)的转录表达。我们的实验结果表明:SIAH能够与PHC2在体内外发生相互作用,并可共定位于HeLa细胞的细胞核中;SIAH的Cys-rich domain、PHC2的PxVxAxP基序在两者结合中起到重要作用;在哺乳动物细胞293T中,SIAH可促进PHC2的泛素化,并使之由泛素-蛋白酶体途径降解。为了验证两者的E3酶一底物关系,我们构建了两个突变体SiahR及Siahm,前者可与PHC2结合但失去E3连接酶活性,后者保有E3转接酶活性但与PHC2结合能力大大下降。结果表明这-两个突变体泛素化降解PHC2的能力远逊于野生型,证实了PHC2是SIAH的泛素化降解底物。PcG基因的突变会导致动物体发育缺陷、肿瘤形成,PHC2作为classⅡPcG复合物中的重要一员,在胚胎形成、脑的早期发育中也都有重要作用,因此研究SIAH对PHC2的降解调控对探索PHC2在发育早期的调控机制有重要意义。 在第二部分中,我们发现EEF1D能与SIAH相互作用并抑制其E3连接酶活性。 EEF1D(eukaryotic translation elongation factor 1 delta,也称为eEF1Bδ或eEF1δ)是真核生物翻译延伸因子eEF1B复合物中的一个亚基。eEF1B复合物是的eEF1A的转换因子(exchange factor,GEF),可激活eEF1A上的核苷转换,使脱离核糖体的非活性eEF1A-GDP转变为可再度结合核糖体的活性eEF1A-GTP,从而完成eEF1A的活力循环。前人的研究表明EEF1D在病毒感染、细胞周期、肿瘤发生中都发挥了作用。我们发现SIAH能够与EEF1D在体内外发生相互作用;共定位实验结果显示两者能够共定位于HeLa细胞细胞质中;系列缺失实验发现SIAH的Cys-rich domain在两者结合中起到重要作用。在293T细胞中,EEF1D蛋白质水平不随SIAH的增加而变化,该结果提示其不是SIAH的底物。但是,SIAH蛋白质水平却会随EEF1D表达量增加而增加,蛋白稳定性测试的实验结果表明这种增加缘于EEF1D会抑制SIAH的降解,从而导致SIAH蛋白水平的增加。此外,EEF1D能抑制SIAH的自泛素化,也能抑制SIAH对PHC2的降解。根据以上结果,我们发现EEF1D可抑制SIAH的E3连接酶活性,从而导致其自身降解水平及降解某些底物能力的下降,这为研究SIAH的调控机制提供了新线索。
EEF1D蛋白;E3连接酶;PHC2蛋白;SIAH因子;相互作用;生理学;泛素化
复旦大学
博士
遗传学
霍克克
2009
中文
Q753;Q786
107
2012-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）