裂殖酵母ING家族蛋白Png1p在DNA损伤应答过程中的功能研究
本研究分为二部分： 第一部分、裂殖酵母ING家族蛋白Png1p在DNA损伤应答过程中的功能研究 ING家族蛋白(Inhibitor of Growth)作为一类肿瘤生长抑制因子，在几乎所有的真核细胞中都含有保守的同源蛋白，并广泛参与细胞凋亡，衰老，细胞周期调控，DNA损伤应答，细胞分化，肿瘤生长，激素信号传递，基因表达和染色质重构等多种过程。对ING家族蛋白参与DNA损伤修复的过程已经进行了许多的研究，但是由于ING家族蛋白参与DNA损伤修复的分子机制比较复杂，对于ING家族蛋白在DNA损伤信号传导通路上发挥的具体功能至今还未能完全有效解析。 裂殖酵母细胞含有两个ING家族蛋白：Pnglp和Png2p。至今为止，在裂殖酵母细胞中还没有关于ING家族蛋白参与DNA损伤应答的报道。同源进化分析表明：Pnglp和Png2p虽然同属ING家族，但两者位于系统发生树的不同分支上。进一步，我们通过同源重组的方法成功地敲除了两个基因的ORF，获得了突变体△pngl和△png2。功能分析表明PNG1和PNG2在细胞生长和DNA损伤应答过程中执行了不同功能。 细胞生长和流式细胞术分析表明PNG1基因不仅是细胞正常生长所必需的，同时也是DNA损伤修复所必需的，PNG1的缺失使细胞阻滞在了S期。酵母双杂交，Pull-down实验，Co-IP实验，荧光共定位实验表明Pnglp与组蛋白乙酰转移酶Mstlp密切相关，但两者可能没有直接的相互作用。TSA拯救实验和western blot检测表明Pnglp参与了组蛋白H4的乙酰化修饰。PNG1基因的缺失使DNA损伤条件下裂殖酵母H4K5、K8、K12位的乙酰化水平下降，并且这种乙酰化程度的下调直接抑制了DNA损伤修复相关基因（如RAD22，ASFl,SPT3）．染色质重构相关基因（如SNF5），细胞周期相关基因（如CDC20,CDC22，ENGl,AGN1）的表达。更进一步的研究发现，在PNG1缺失突变体中分别过量表达DNA损伤修复核心基因RAD22可以拯救PNG1缺失带来的DNA损伤敏感的表型。因此，PNG1很可能通过RAD22途径参与了DNA损伤应答过程。 第二部分、水稻中DREB基因抗旱功能的初步研究 DREB家族转录因子是一类参与调控植物体对干旱应答的重要的调节因子。这类转录因子可以特异性地结合到C-repeat/DREIi~式元件上(核心序列为A/GCCGAC)，并以一种不依赖于ABA的方式，调控下游许多低温或干旱诱导基因的表达。在我们的研究中，我们在水稻中分离了3个新的水稻中的DREB家族转录因子：OsDREBIE、OsDREBIG和OsDREB2B。这三者与拟南芥中的DREB家族转录因子具有序列和结构上的高度同源性。酵母单杂交试验表明这三者可以特异性地结合到C-repeat/DRE顺式元件上。为了研究这三个基因在水稻中的功能，我们通过农杆菌介导的转基因方法将这三个基因在水稻中过量表达。对转基因水稻植株的分析表明，过表达OsDREBIG和OsDREB2B可以显著提高水稻对于干旱的耐受能力，但是过表达OsDREBIE只能稍微提高水稻对于干旱的耐受能力。这一实验结果表明，水稻中不同的DREB基因可能通过不同的方式参与干旱等压力应答的途径。
裂殖酵母;ING家族蛋白;DNA损伤;修复机制;Pnglp因子;流式细胞术
复旦大学
博士
遗传学
吕红
2009
中文
Q523
117
2012-12-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）