抗白叶枯病菌放线菌的筛选、鉴定和生物防治作用的初步研究
水稻白叶枯病是水稻主要病害之一，由水稻黄单胞杆菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzae，Xoo)引起的。该病害可对水稻生产造成重大影响，严重时可能颗粒无收。现阶段的主要防治途径是进行化学防治，过量施加杀枯净、噻枯唑等药剂会导致病原菌抗性增强和生态环境的严重破坏。
放线菌类尤其是链霉菌类普遍应用于抗生素生产，菌体广泛存在于土壤中。研究结果显示，链霉菌产生的抗生素类物质属于次级代谢产物，可以于自然环境中发生降解。其产生的抗生素类物质，可以特异地作用于某些病原菌，降低其生长和繁殖速度，进而可以降低病害发作的程度。这类抗生素类物质，可以被作为生物农药用于农业生产中，在病害的生物防治中发挥着重要作用。因此，从自然环境中筛选一种对白叶枯病菌具有拮抗作用的放线菌菌株，是白叶枯病防治的一个重要方向。
1:从浙江省金华市郊区水稻试验田的土壤中筛选获得一株抗白叶枯病菌的放线菌ACT-2菌株。经形态学、16S rDNA序列分析以及进化树建树分析，鉴定为白蚁链霉菌（Streptomyces termitum）。生理生化试验结果显示，ACT-2可以适应绝大多数碳源、氮源，可以降解淀粉、尿素和酪蛋白等大分子物质;对环境因素耐受能力测定显示，其对高温、pH和高盐度等极端环境有一定的耐受能力。ACT-2菌株的菌体以及发酵液均对白叶枯病菌表现出明显的拮抗作用，抑菌圈直径分别达到38.00 mm和21.73 mm。经发酵条件优化，结果显示:ACT-2菌株在培养温度28℃、初始pH7.5、摇床转速180 r/min、装液量50/250 ml时，发酵液的抑菌效果达到最大，抑菌直径达到26.20 mm。
2:选取多种植物病原真菌和病原细菌作为供测菌，测定白蚁链霉菌（Streptomyces termitum）ACT-2菌株的抗菌谱。测定结果显示:ACT-2菌株发酵液对病原细菌具有较强的拮抗能力，可以形成直径大于20.00 mm的抑菌圈;对植物病原真菌抑制效果并不特别显著。以水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)生理小种P6菌株为指示菌，测定了ACT-2菌株发酵液的抑菌稳定性，发酵液的抑菌稳定性试验显示:当温度低于80℃、光照强度为4000 lx或经紫外光(40 w)处理后，ACT-2菌株发酵液均可保持稳定的抑菌能力;当温度高于90℃时，抑菌作用开始降低;发酵液对酸碱度较敏感，经酸碱环境处理后，发酵液的抑菌作用出现了明显降低;随着酸碱度的增加，发酵液的抑菌能力出现下降。
3:防效试验，测定了白蚁链霉菌（Streptomyces termitum）ACT-2菌株发酵液对水稻白叶枯病的防效。通过人工剪叶侵染处理4种感病水稻叶片，并以方法①（先用发酵液处理，后侵染处理）和方法②（先侵染处理，后用发酵液处理）等两种不同方法分别处理。试验结果显示:病斑抑制比例最大为70.97％，病情指数最大下降了43.04％，防治效果最高可达80.80％。试验结果显示，方法①较之方法②的防治效果更佳理想一些，方法①更侧重于预防。这说明，在对水稻白叶枯病防治中，预防手段比之治疗手段，效果更理想。
4:按萃取剂极性，分别设定石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇作为萃取剂。通过分步萃取的方法，选择有效的萃取剂，经抑菌验证，确定抑菌成分在乙酸乙酯相;将萃取物通过200-300目硅胶柱层析，梯度洗脱，抑菌作用测定，确定二氯甲烷为洗脱剂，得到含有抑菌成分的洗脱相;通过LH-20凝胶柱层析，以甲醇洗脱，得到纯的抑菌成分，25℃静置48 h获取结晶。结晶呈黄色或者淡橙色，形状不规则，难溶于石油醚，微溶于二氯甲烷和氯仿，易溶于丙酮、甲醇和二甲基亚砜。结晶具有轻微抗生素气味，无刺激性味道。由氢谱和质谱的结果，分析可知:1H NMR(400.13 MHz,d6-DMSO)∶7.72(t,J=8.0 Hz,1H),7.63(d,J=1.8,1H),7.45(d,J=8.0 Hz,1H),7.32(d,J=8.0,1H),7.04(d,J=1.8 Hz,1H),2.69(s，3H)。ESI-MS∶253.1（[M-1]-）。经比对该物质为AloesaponarinⅡ（1-甲基-3，8-二羟基蒽醌），分子式为C15H10O4。
本研究结果显示，白蚁链霉菌ACT-2菌株可以产生AloesaponarinⅡ，该物质对水稻白叶枯病菌有高效拮抗能力，防效试验结果显示该菌株生防试验中对白叶枯病同样具有良好的防治作用。
水稻;白叶枯病;白蚁链霉菌;放线菌;生物防治;分离鉴定
浙江师范大学
硕士
植物学
蒋冬花
2012
中文
S476.11;S435.111.42
81
2012-11-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）