产聚-β-羟基丁酸菌株筛选及发酵和提取工艺研究
聚-β-羟基丁酸(Poly-β-hydroxybutyrate，PHB)是微生物在碳、氮等营养失衡的条件下合成的碳源与能源的高分子储存物（分子量50000-1000000）。作为微生物合成的可降解材料，PHB除了具有与化学合成高分子相似的理化性质，还具有一般化学合成高分子所没有的性质如光学活性、低透氧性、抗紫外辐射、生物可降解性、生物相容性、压电性和抗凝血性等，在工业、农业、环保、食品、医药等领域具有十分广阔的应用前景。如在医疗领域，PHB可以作为药物基质植入人体，以控制药物的释放，且最终降解产物为β-羟基丁酸，没有任何毒副作用。
本文从自然环境分离得到一株较高产PHB苏云金芽孢杆菌菌株PX-95，通过培养基组分、培养条件优化提高PHB产量;通过提取条件优化提高PHB的提取效率，从而最大化PHB产量;最后实验中的提取物纯化分析，判断其结构、纯度等。
首先，从浙江省各地（杭州、温州、宁波、金华、绍兴、丽水、台州）采集的土壤（主要来源有玉米地、番薯地、花生地等），分离筛选芽孢杆菌菌株188株。通过对PHB的定性和定量筛选等手段获得较高产PHB菌株，同时进行连续传代培养以获得PHB产量及遗传性状稳定的目的菌株。
其次，单因素法优化培养基组分及培养条件。利用响应面法研究对PHB产量影响较大的5个因素（初始pH、培养温度、蔗糖浓度、蛋白胨浓度、总磷浓度）之间的交互关系以及最佳值。利用响应面法建立回归方程。通过计算获得最优发酵条件为:初始pH为7.44，培养温度为30.15℃，蔗糖浓度为51.31 g/L，蛋白胨浓度为21.06 g/L，总磷浓度为0.13 g/L。经单因素及响应面优化后PX-95的PHB产量为8.934 g/L，为筛选时PHB产量(0.136 g/L)的66倍。
然后，为了尽可能的使PHB产量最大化，还对提取工艺进行了初步研究。主要从单因素实验的基础上再进行响应面优化提取条件。从单因素实验得出提取温度、提取时间和提取物料比对PHB提取率影响较大。通过响应面法优化PHB提取条件，得到一个二次多项式回归模型(R2=0.9957)，模型失拟项不显著(P=0.141＞0.05)，拟合度良好，这说明采用响应面法得到的工艺参数较为可信。最终结果表明PHB的最佳提取条件:提取温度为60.4℃、提取时间为2.2 h和提取物料比为40.5 mL/g，此时PHB提取率达87.31％。
最后，将实验提取获得的粉末状或薄膜状固体采用紫外吸收光谱(UV)、核磁共振(NMR)等手段进行了分析，并与标准品进行比较。紫外吸收光谱中无杂质峰并且与PHB标准品的吸收峰一致，初步确定该提取物为PHB类似物，在浓硫酸降解过程中出现巴豆酸;核磁共振中的氢谱和碳谱分析可知，该提取物的结构为—[—O—CH(CH3)—CH2—CO—]—n。综合结果表明，从苏云金芽孢杆菌内提取获得的物质为聚-β-羟基丁酸(PHB)并且纯度接近100％。
苏云金芽孢杆菌;聚-β-羟基丁酸;菌株筛选;发酵工艺;响应面法
浙江师范大学
硕士
植物学
蒋冬花
2012
中文
TQ921.4;Q939.124
108
2012-11-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）