水稻白叶枯病无毒因子Ax21成熟机理初探
白叶枯病是仅次于稻瘟病的水稻第二大病害，Xa21是最早发现的白叶枯病抗性基因，具广谱抗性，其无毒基因ax21在2009年底被确定。ax21翻译产物Ax21(activator of XA21-mediated immunity)为194个氨基酸的蛋白质，包含外泌信号肽，硫酸化17肽axY(s)22，后续多肽链三个部分。Ax21是目前发现首个直接作用于宿主受体，引发抗性反应的群体感应因子，也是革兰氏阴性菌中首次发现的介导调控运动，生物膜形成，毒力相关基因表达的群体感应因子。目前，已相继发现raxST，RaxP，RaxH等十余个基因参与Ax21的翻译及活性调控。
研究发现，Ax21硫酸化17肽是引起水稻抗性的活性物质，Ax21的成熟必须经N端第22位酪氨酸的硫酸化修饰，Ⅰ类分泌系统(typeⅠ secretion system，TOSS)分泌出胞外，蛋白酶切去后续多肽链等过程。为探究Ax21成熟机理，我们主要进行了三部分的研究工作:Ax21硫酸化部位定位与酶切部位定位;RaxST与Ax21蛋白的表达纯化;农杆菌介导SAC基因转化水稻。
研究表明RaxST利用PAPS作为硫酸根的供体催化Ax21的硫酸化。构建raxST C端具CFP的单交换载体pSKB4-raxST-CFP，电转化至感受态白叶枯病菌PXO99，经氨苄青霉素抗性筛选获得单交叉重组菌株。通过荧光显微镜观察，发现CFP荧光信号位于胞内，推测Ax21的硫酸化发生于白叶枯病菌细胞内。蛋白酶切去后续多肽是Ax21成熟的必须过程，构建了Ax21 C端具GFP的单交换载体pSKB4-ax21-GFP，通过电转化至感受态白叶枯病菌PXO99，经氨苄青霉素抗性筛选获得单交叉重组菌株。通过荧光显微镜观察发现GFP荧光信号位于胞内，推测Ax21的蛋白酶切发生在胞内，或GFP的存在影响了Ax21的分泌。
Ax21硫酸化由RaxST催化完成，目前尚没有对RaxST的催化活性及反应具体条件进行分析。我们分别把Ax21与RaxST构建到原核表达载体pET30a与pSKB4中，高效表达Ax21与RaxST蛋白，电泳发现Ax21与RaxST均存在于包含体。通过尿素溶解，复性纯化，我们得到了较高纯度的Ax21与RaxST蛋白，为Ax21体外硫酸化活性分析奠定了基础。
硫是生命活动必须的化学元素，研究表明许多含硫化合物参与了植物细胞的防卫反应，大田实验也表明硫可以诱导植物抗病性的产生。Ax21的成熟也必须经历硫酸化修饰，本实验室研究表明，施硫量的多少，影响水稻对白叶枯病的抗性。利用转基因技术，我们将高效同化硫的球形红细菌SAC基因转化入水稻，获得了32个转基因株系，为进一步分析硫代谢对水稻的抗病能力奠定了基础。
水稻;白叶枯病;无毒因子;抗性基因;蛋白酶切;荧光定位
浙江师范大学
硕士
植物学(植物生物技术方向)
孙梅好
2012
中文
S435.111.42;S432.21
80
2012-11-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）