鲤鱼肌肉脯氨酸内肽酶的分离纯化及性质分析
脯氨酸内肽酶(Prolyl endopeptidase，PEP)在自然界的分布广泛，从多种哺乳动物、微生物和植物中已有较多发现。PEP是一类能特异性水解多肽链中脯氨酸残基羧基端肽键的内切酶，在医药领域和工业领域得到了广泛的应用。由于PEP能够有效的降解富含脯氨酸残基的多肽类物质，推测其与动物肌肉中胶原蛋白的新陈代谢有着密切的关系。但是，迄今为止，国内外对于鱼类肌肉中PEP的研究报道极少。
本文以淡水鲤鱼为原料，采用硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sephacel阴离子交换层析、Phenyl-Sepharose疏水层析、DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和Hydroxyapatite等方法从鲤鱼肌肉中分离纯化得到一种脯氨酸内肽酶。SDS-PAGE结果显示，鲤鱼PEP为单体结构，分子量为82 kDa。
酶学性质分析表明，PEP的最适pH为6.0，当pH在5.0-8.0之间时，有较好的稳定性。酶的最适温度为35℃，其热稳定性较差。热失活动力学实验测定结果显示，自由酶的热失活速度常数(k+0)明显大于酶与底物结合物的失活速度常数(k'+0)，表明底物对该酶的热失活作用具有一定保护作用。在pH6.0的条件下，PEP在35℃和40℃时半衰期分别为105 min和10 min。
不同蛋白酶抑制剂对酶活性影响的实验结果表明，PEP的特异抑制剂SUAM-14746对酶活性具有强烈的抑制作用，丝氨酸蛋白酶抑制剂(PMSF和Pefabloc SC)能够部分抑制酶的活性，而其他的丝氨酸蛋白酶抑制剂(LBTI，Aprotinin，Benzamidine和Leupeptin)对酶的活性没有影响，金属蛋白酶抑制剂(EDTA和EGTA)和半胱氨酸蛋白酶抑制剂(E-64)均没有表现出抑制作用。以上结果表明，PEP是一种特异性的丝氨酸蛋白酶。
以Suc-Gly-Pro-MCA为底物，根据Lineweaver-Burk双倒数作图，计算动力学参数Km和kcat值，结果显示鲤鱼PEP的Km为8.33μmol/L，kcat为1.71 S-1。底物特异性实验结果表明，PEP能够特异分解肽链羧基端含有脯氨酸残基的荧光底物以及肽链中含有脯氨酸残基的小肽(Neurotensin和Bradykinin-Potentiator B)，这一结果表明了鲤鱼PEP可能是参与鱼肉胶原蛋白降解的一种重要蛋白酶。
肽指纹质谱分析得到134个氨基酸残基，与海绵(Amphimedon queenslandica)PEP的同源性为100%；与斑马鱼(Danio rerio)PEP氨基酸同源性为61.2%。进一步证明得到的酶为脯氨酸内肽酶。
脯氨酸内肽酶;鲤鱼肌肉;性质分析;分离纯化
集美大学
硕士
微生物学
曹敏杰
2012
中文
TS254.1
60
2012-11-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）