马铃薯晚疫病水平抗性相关的小G蛋白基因克隆与功能分析
随着人口的持续增长和耕地的减少，粮食安全备受国际关注。有专家认为，到2050年，即使是发达国家也要重新考虑吃饭问题。而目前担当粮食安全重任的水稻、玉米、小麦也不能彻底解决这一问题。因此，在应对未来可能面临的粮食危机，马铃薯作为解决粮食安全问题和扶贫领域的重要性越发突出。然而，由致病疫霉菌(Phytophthora infestans)引起的晚疫病仍然是马铃薯生产中的主要制约因素。迄今为止，培育抗病品种仍然是解决这一问题的有效途径。近年来由于农业生物技术的发展，利用抗病基因培育稳定、持久抗性品种的工作越来越受重视。所以，本文旨在通过分离与马铃薯晚疫病水平抗性相关的基因，进一步研究其在晚疫病抗性中的功能，为抗病基因在培育抗病品种中的应用奠定基础。主要内容如下：
1.利用RACE方法结合PCR技术，从水平抗性材料386209.10中克隆了一个小G蛋白基因。该基因全长为889 bp，包含一个612 bp的开放阅读框，编码203个氨基酸，Genbank登录号为EF091876。其与烟草NtRabla基因有91%的一致性，因此命名为StRab。序列分析表明，该基因具有Rab家族所特有的保守区域，进一步证明其为Rab基因家族的成员。
2.为了研究StRab在晚疫病抗性中的功能，我们将其引入真核表达载体pBI121的CaMV35S启动子下构建了超量表达载体，另外，将其部分片段(约500 bp)以方向相反的方式通过重组插入到表达载体pHGRV的CaMV35S启动了下构建了干涉表达载体。通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens，LBA4404)介导转化马铃薯品种鄂马铃薯3号的试管薯薯片，分别获得34个超量株系和29个干涉株系。Southern杂交分析表明该基因已经整合到马铃薯基因组中且有1-5个拷贝。但是进一步的RT-qPCR分析表明，超量株系的表达均比对照高，甚至高于对照几十倍，而干涉株系的表达效果不理想，平均为对照的1.41倍。接种鉴定的结果表明该基因超量表达后对晚疫病抗性有显著作用，而抑制表达后则没有差异。
3.另外，我们还构建了pBI121-StRab-gfp融合表达载体，通过农杆菌侵染洋葱表皮，对，StRab的亚细胞定位进行了分析，结果将StRab定位在细胞质膜上。为进一步研究提供了线索。
4.为了揭示StRab的功能机理，我们采用酵母双杂交的方法获得了StRab蛋白的下游效应子。其中的支架蛋白、ERF转录因子、蛋白酶抑制子、多聚泛素、多酚氧化酶和几丁质酶等均与抗病密切相关。根据目前资料分析，StRab蛋白的作用机理可能有两种：一是StRab蛋白作为运输小泡的关键调节因子，通过运输小泡间接地参与到抗病作用中；二是通过对StRab蛋白下游效应子的分析，我们推测StRab蛋白可能通过其下游效应子直接参与到抗病信号传递途径或者其它抗病相关的过程。但是，关于功能机理的问题仍然是复杂的难点问题，也是今后研究的重点问题。
马铃薯;小G蛋白;StRab蛋白;抗病品种;基因克隆
华中农业大学
博士
蔬菜学
谢从华
2012
中文
S532.034
119
2012-11-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）