根癌农杆菌介导PTLRP1基因转化枳壳和烟草的研究
根型的好坏与植物吸收土壤养分和水分的能力直接相关，但根型易因土壤养分的丰缺而发生相应的调整。根型在营养胁迫条件下的变化固然是受碳水化合物分配、激素运输及分配等生理过程的影响，但归根结底是基因表达调控的结果。课题组前期的研究结果表明，缺硼导致柑橘根型发生了极大的改变，其主要特点是侧根的伸长发育严重受阻。关于影响根型发育的分子机制，最近在拟南芥、水稻、玉米等作物上开展了大量研究，并取得了重要进展，但对木本植物的研究报道相对较少，缺硼对柑橘根型影响的分子机理尚不清楚。本研究以前期在枳壳中克隆的控制侧根发育的关键基因PtLRP1为主，采用农杆菌介导的转基因手段，将PtLRP1基因导入到模式植物烟草以及目标植物枳壳中，且借助原位杂交实验为进一步验证该基因的功能和解明缺硼抑制侧根发育的分子机理奠定基础。主要工作和结果如下：
(1)PtLRP1超表达载体的构建
为了验证本实验中获得的与侧根发育有关的PtLRP基因的功能，成功构建了pCAMBIA1302-LRP1超表达载体。该载体为pCAMBIA1302，是一种常用的植物表达载体，载体的骨架是pUC18，其T-DNA区包含CaM35S启动子，且具有潮霉素(hygomycin B)抗性基因和绿色荧光蛋白GFP的报告基因，pCAMBIA1302载体上目的基因两端的位点处具有BglⅡ和ApeⅠ两个酶切位点，利用primer5软件对LRP1基因序列进行检测发现这两个酶切位点在目的基因中并没有出现，因此可以准确的控制插入的方向。
(2)烟草阳性苗的获得
采用农杆菌介导叶盘转化法将pCAMBIA1302-LRP1导入烟草植株中，在含有2.5mg/L潮霉素的MS诱芽培养基上进行诱芽和筛选培养，待抗性芽长至适宜大小后，进行生根培养，最后将生根苗移出培养基，栽种于无菌的培养土中一直待到开花结实。为了确定LRP1基因是否成功导入烟草植株中，分别提取转基因烟草和野生型烟草中的DNA，然后以pCAMBIA1302-LRP1超表达载体质粒DNA为阳性对照，以野生型烟草DNA为阴性对照，以转基因烟草叶片DNA为待检测模板进行PCR检测。用LRP1-F和LRP1-R这对引物，转基因烟草苗和阳性对照在1500bp左右处获得了较为明亮的目的条带，用hygⅡ-FF和hygⅡ-R这对引物进行检测，在850bp左右处发现亮带。实验中还将检测的目的条带，进行了纯化回收并测序。PCR的检测的最终结果表明获得了15株转了目的基因的烟草阳性苗，以及21株转了空载的烟草阳性苗。
(3)枳壳阳性苗的获得
采用农杆菌介导枳壳上胚轴的遗传转化法，将pCAMBIA1302-LRP1载体导入到枳壳中，同样在含有2.5mg/L潮霉素的MT诱芽培养基上分别进行诱芽和筛选培养，经2周的暗培养之后转入光下培养，每25d继代一次。待愈伤处抗性芽长至0.5cm以上将其连同部分茎段一同切下转入MT伸长培养基上进行伸长培养，同样是25d继代一次，待芽体长至一定大小，将其移入生根培养基上诱导生根。由于枳壳转化苗生长较慢，苗子较小，不宜用来提取DNA/RNA对其进行遗传鉴定，而本实验中使用的载体是pCAMBIA-1302，该载体中含有GFP报告基因，因此利用体式荧光显微镜对早期枳壳转化苗进行了初步鉴定，结果发现在一些枳壳转化苗的叶片和茎段处尤其是叶片处有点状绿灯般晶莹通透的荧光发出，而另一些转化植株则未发现有荧光反应发生，这些发出荧光的植株是否为阳性苗还有待于之后进一步的遗传鉴定。
(4)原位杂交
为了精确的了解LRP1基因在枳壳根系中的表达，本研究利用地高辛标记的PtLRP1基因的正反义RNA探针对枳壳根系进行了组织原位杂交分析。将采取的植物样品放于FAA固定液中，经抽真空、脱水、透明、浸蜡最终包埋在石蜡中，切片，将带有材料的蜡带粘贴在抹有多聚耐氨酸的切片上，30℃展片30min后，放于37℃烘箱烘2天，烘一天后用显微镜进行镜检，挑出十张较好的片子用于原位杂交实验，结果表明，PtLRP1在中柱鞘部位表达较明显，这与前人的研究相似。
根癌农杆菌;PTLRP1基因;枳壳转化苗;植物烟草;分子机制;生长发育
华中农业大学
硕士
林学
张卓文;梅莉
2012
中文
Q943.2
59
2012-11-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）