Saccharomonospora viridis α-葡萄糖苷酶基因的功能鉴定及分子改造
α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase，EC3.2.1.20)是一类从含有α-糖苷键底物的非还原末端催化水解α-葡萄糖基酶的总称。该酶是工业上生产低聚异麦芽糖的关键酶制剂，低聚异麦芽糖是一种功能性低聚糖，具有良好的促进双歧杆菌生长、降低血脂和抗龋齿等生物性功能，已广泛应用于食品、医药等领域。因此，α-葡萄糖苷酶在低聚异麦芽糖的工业生产上受到了极度的关注。
本研究利用PCR的方法从绿色糖单孢菌(S.viridis)中克隆到一个假定为糖苷酶的ORF，并成功在E.coli Rossetta(DE3)中进行表达，研究表明该ORF是编码一种α-葡萄糖苷酶。利用镍柱将重组酶pSE380-Svg进行纯化，SDS-PAGE电泳检测纯化的目的蛋白条带约为53 kD。重组酶作用于对硝基苯基-α-D-葡萄糖苷(pNPG)和蔗糖的最适温度分别为45℃和50℃，最适pH均为7.5，Km值分别为2.32 mmol/L和6.05 mmol/L，比活力分别为911.68 U/mg和189.80 U/mg。该酶能够水解pNPG、蔗糖、麦芽糖和麦芽三糖，但不能水解海藻糖、α-环糊精、β-环糊精、普鲁兰糖、可溶性淀粉、糯米淀粉。
本研究还通过SWISS-MODEL网站对S.viridisα-葡萄糖苷酶进行同源建模，以Pseudomonas mesoacidophila的蔗糖异构酶(2pwfD)为模板进行比对分析，确定了活性位点入口附近的F282、W260和R266进行定点饱和突变，以期提高α-葡萄糖苷酶的酶活力或改变产物特异性。通过反向PCR和突变体库的构建，从中筛选到三个有活力的突变体：F282L、R2661和R266Y。利用底物pNPG对突变酶进行酶学性质研究发现，与野生酶相比较，突变酶的比活力大大的降低，最适pH均没有发生改变；突变酶F282L和R266Y的最适温度分别升高和降低了5℃，而R2661的最适温度却没有发生变化；突变酶R266Y的Km比野生酶的有所降低，这说明其与底物pNPG的亲和力加强了，其余两个突变酶的Km都有所升高而降低了与底物pNPG的亲和力。HPLC分析结果表明，突变酶和野生酶分别与10%麦芽糖作用，均发生了一定转糖苷反应，但突变酶的转糖苷活力均比野生酶的低，并且产物并没有发生改变。
绿色糖单孢菌;α-葡萄糖苷酶;酶学性质;定点饱和突变;分子改造
广西大学
硕士
微生物学
韦宇拓
2012
中文
Q556.2
88
2012-11-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）