蜡样芽孢杆菌GXBC-3三个普鲁兰酶基因的克隆表达、酶学性质研究及分子改造
探索获得新型优良的普鲁兰酶基因，丰富普鲁兰酶研究理论，对实现普鲁兰酶的国产化具有深远意义。以开发工业用普鲁兰酶的为目的，采集不同土壤样品混合堆肥，利用平板分离法从中筛选、分离得到一株产普鲁兰酶菌株。经过形态学特征和生理生化特征观察，并结合其16SrDNA系统发育分析鉴定其为蜡样芽孢杆菌属，命名为Bacillus cereus GXBC-3。通过分析GenBank数据库中蜡样芽胞杆菌假定Ⅰ型、Ⅱ型普鲁兰酶基因序列，从Bacillus cereus GXBC-3中克隆得到三个普鲁兰酶基因pulA、pulB和pulC，并分别导入大肠杆菌Escherichia colii XL10-Gold得到高效诱导表达。通过镍柱亲和层析获得纯化重组酶PulA、PulB和PulC，其蛋白表达量和相对分子质量分别为4.23 mg/mL、84.56 kDa，6.43 mg/mL、94.71 kDa和3.33 mg/mL、95.37 kDa。
酶学性质研究表明重组酶PulA能水解α-1，6-和α-1，4-糖苷键，为Ⅱ型普鲁兰酶，以普鲁兰糖为底物时，最适反应温度及pH分别为40℃和6.5，其比活力、Km和Vmax分别为32.89 U/mg、0.33 mg/mL和40.65μmol/minmg；以可溶性淀粉为底物时，最适反应温度及pH分别为50℃和7.0，其比活力、Km和Vmax分别为25.71 U/mg、2.63 mg/mL和92.59μmol/minmg。重组酶PulB和PulC二者均只能水解α-1，6-糖苷键，为Ⅰ型普鲁兰酶，以普鲁兰糖为底物时，重组酶PulB的最适反应温度及pH分别为45℃、7.0，其比活力、Km和Vmax分别为228.54 U/mg、1.17 mg/mL和434.78μmol/minmg；而重组酶PulC的最适反应温度及pH分别为45℃、6.5，其比活力、Km和Vmax分别为229.65 U/mg、1.96 mg/mL和400.00μmol/minmg。
利用反向PCR对重组酶PulA、PulB和PulC进行初步分子改造，得到5个缺失子，其中缺失酶QSPulA和QSPulB不表达；而缺失酶QSPulC-1、QSPulC-2和QSPulC-3小量表达，其纯化酶学性质研究结果表明：(1)缺失酶QSPulC-1、QSPulC-2和QSPulC-3除具普鲁兰酶活性还具有低活力的淀粉酶活，表明N端结构域Pfm PUD的缺失或不完整能将Ⅰ型普鲁兰酶转化为Ⅱ型普鲁兰酶。(2)缺失酶QSPulC-1、QSPulC-2和QSPulC-3的表达量均严重下降，由3.33 mg/mL的表达量降至不足1 mg/mL，表明N端结构域Pfm PUD的缺失或不完整能显著降低酶的表达量。(3)缺失酶QSPulC-1、QSPulC-2和QSPulC-3的普鲁兰酶的比活、Km和Vmax均显著降低，表明N端结构域Pfm PUD的缺失或不完整能显著降低酶的普鲁兰酶活性。
蜡样芽胞杆菌GXBC-3;普鲁兰酶;基因克隆;酶学特性;分子改造
广西大学
硕士
微生物学
违于拓
2012
中文
S154.381
105
2012-11-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）