猪甲状腺激素应答基因(SPOT14)的克隆与原核表达
甲状腺激素应答基因(Thyroidhormoneresponsivegene，SPOT14)是受甲状腺激素诱导表达的核内基因，在动物肝脏、脂肪组织中高表达，该基因参与脂肪合成代谢途径限速酶的转录调控，对动物脂肪生成具有重要的调控作用。为进一步研究猪SPOT14基因所编码蛋白质的生物学功能，本试验基于电子延伸序列，设计其克隆引物，利用RT-PCR方法成功克隆了猪SPOT14基因，并检测了该基因在各组织的分布情况。进而构建了猪SPOT14基因的原核表达载体pET-28α(+)-S14，并诱导表达了融合蛋白，经SDS-PAGE电泳分析和Westernblot检测确定该融合蛋白为S14，其蛋白分子量为20.91kD。结果表明：
1.猪SPOT14基因的克隆、序列分析与组织分布。
克隆的猪SPOT14基因包含一个完整的开放阅读框架(openreadingframe，ORF)，长度为453bp，编码由150个氨基酸组成的S14蛋白(GenBank：JF951726)，其中酸性氨基酸35个，碱性氨基酸23个，蛋白质分子量为：17.08kD，等电点为：6.15。其氨基酸序列与人、牛、小鼠、褐鼠、兔、鸡的同源性分别为76.9％、80.89％、76.2%、76.2%、82.1％、32.0％，构建的系统发育树显示猪与牛的亲缘关系最近。该基因在肝脏和脂肪组织中高表达，在脑、脾脏、胃、皮肤、盲肠、直肠中表达量相对较低，在肺脏、十二指肠、空肠、回肠中微量表达，在肾脏、肌肉中无表达。
2.猪pET-28α(+)-S14原核表达载体的构建与鉴定
为了获取S14的蛋白质分子，本试验根据克隆序列合成一对表达引物，将猪SPOT14基因的ORF片段克隆到原核表达载体pET-28α(+)中，经菌液PCR鉴定、双酶切鉴定、测序鉴定，确定猪SPOT14基因插入的位置、大小和读码框均正确，证实成功构建了原核表达载体，将其命名为DET-28α(+)-S14。
3.猪SPOT14基因在大肠杆菌中的表达
将获得的重组质粒pET-28α(+)-S14转化入大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)感受态细胞，分别用不同终浓度的IPTG和不同的诱导表达时间进行诱导，以确定蛋白表达的最佳条件。在最佳诱导条件下经IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳检测，表达的融合蛋白分子量约为21kD，且主要以包涵体形式存在。
4.猪pET-28α(+)-S14重组蛋白的纯化与鉴定。
将获得的包涵体用6xHisNi-NTA纯化柱纯化后，通过SDS-PAGE分析，出现单一目的条带，表明已纯化得到融合蛋白。以鼠抗6×His标签单克隆抗体和HRP标记的羊抗鼠lgG二抗对纯化产物进行免疫印迹检测，结果在目的条带所处位置(20.91kD)出现一条印迹，且分子量大小与目的蛋白的相同，证实该蛋白为所需要的目的蛋白S14。
猪;甲状腺激素应答基因;组织分布;原核表达;免疫印迹
河南农业大学
硕士
基础兽医学
杨国宇
2012
中文
S828
50
2012-11-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）