利用mRNA差异显示技术克隆球孢白僵菌在蝉蜕和蚕血淋巴诱导下的特异表达基因
随着人们对环境保护认识的加深，由化学农药产生的3R问题已经越来越受到重视。利用生物杀虫剂控制害虫已经是不可逆转的趋势。虫生真菌作为农林生态系中昆虫的重要致死因子，由于其对环境相容，不易产生抗药性，以及资源丰富，开发成本较低等优点，已经被作为控制害虫爆发的重要因子。但是，其应用仍然存在诸多缺点，如药效慢，环境适应性差等。因此，如何提高球孢白僵菌的毒力与抗逆性始终是业内研究的热点。
要改造和构建高毒、速效、稳定的新型白僵菌菌株，必须了解白僵菌侵染昆虫的机制与机理。本研究以球孢白僵菌为研究对象，通过模拟球孢白僵菌侵染昆虫的过程，分析在侵染过程中球孢白僵菌的分子对策，试图发现了一些与侵染过程相关的基因。
首先，本研究对白僵菌进行液体培养，并加入蝉蜕和蚕血淋巴进行诱导培养24h，分别提取诱导菌丝的总RNA，反转录为cDNA，加入差异显示引物进行PCR扩增；PAGE胶电泳后，将胶上的差异条带割胶回收，克隆测序。通过Blast序列比对，结果发现：9个与昆虫侵染机制相关的基因序列，27个假定蛋白基因序列，5个未知序列；其中与侵染过程相关的表达基因，包括：蛋白酶成熟因子、尿囊通透酶、膜上G蛋白、以及第二信使cAMP等编码基因。这些基因在血淋巴和蝉蜕诱导与对照处理下，均存在差异表达。
其次，本研究进一步利用real-time PCR技术对蛋白酶成熟因子的表达进行了精确验证；结果发现：在蝉蜕诱导条件下，与对照处理相比，该基因的表达量为上调了8倍左右。
本研究通过mRNA差异显示技术，分离得到一些与白僵菌侵染昆虫相关的基因并分析了其差异表达情况；本研究的结果为人们进一步探索和阐明白僵菌的侵染机理奠定了基础。
球孢白僵菌;诱导;mRNA差异显示;基因表达;定量分析
安徽农业大学
硕士
森林保护学
黄勃
2012
中文
S763
64
2012-11-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）