草莓镶脉病毒编码的P6蛋白是RNA沉默抑制子
基因沉默是植物依赖核酸序列特异性互作降解外源RNA来抵御病毒入侵的防御机制，许多植物病毒针对这种机制进化出一种反防御机制，即编码不同的沉默抑制子来抑制基因沉默的发生。草莓镶脉病毒(SVBV)是一种能够侵染草莓的潜隐性病毒，经常给生产带来巨大损失。SVBV P6基因编码的P6蛋白除了是症状决定因子以外，还可能是RNA沉默抑制子。本研究以植物表达载体携带的SVBV中国分离物P6基因及其突变分别验证P6蛋白的抑制子功能，最终在分子水平明确P6蛋白作用的机制，对进一步研究病毒和寄主植物之间的防御和反防御机制以控制病毒病的危害都有非常重要的意义。
1.SVBV中国分离物P6基因及其缺失突变体植物表达载体的构建
提取感染中国SVBV草莓叶片的总DNA，设计特异性引物扩增P6全长基因并进行无义突变，将得到的目的基因P6和缺失突变体基因△P6克隆到植物表达载体pCAM-2300和pGR-106上，筛选阳性克隆，得到植物表达载体pCAM-CH P6、pCAM-CH△P6、pGR-CH P6、pGR-CH△P6。
2.局部沉默试验的GFP荧光观察与Real-time PCR检测
植物表达载体pCAM-CH P6、pCAM-CH△P6导入农杆菌EHA105，采用瞬间浸润的方法分别接种转GFP基因本氏烟16c(转GFP基因16c本氏烟)的叶片，以含重组质粒pCAM-P19和空载体pCAM-2300的农杆菌作为对照。接种3d后于紫外灯下观察，浸润部位都产生绿色荧光现象，且亮度差异不大；接种6 d后于紫外灯下观察，pCAM-P19和pCAM-CH P6接种的转GFP基因16c本氏烟叶片的浸润部位出现明显的绿色荧光亮度，且前者稍强，pCAM-CH△P6和pCAM-2300接种的转GFP基因16c本氏烟叶片浸润部位绿色荧光褪去，边缘出现明显的红色边界；拍照保存。
提取各株病汁液和叶片浸润区域的总RNA。利用和Real-time PCR技术检测GFP基因的转录水平。结果发现：GFP基因在接种pCAM-P19的转GFP基因16c本氏烟叶片浸润区域具有很高的转录水平，在接种pCAM-CH P6的转GFP基因16c本氏烟叶片浸润区域也具较高的转录水平，但比前者稍低；在接种pCAM-CH△P6和pCAM-2300的转GFP基因16c本氏烟叶片浸润区域中转录水平很低。
3.系统沉默及回复试验的数据统计、GFP荧光观察
含植物表达载体pCAM-GFP的农杆菌：EHA105接种23株转GFP基因16c本氏烟叶片，接种15 d后于紫外灯下观察，发现其中15株开始发生沉默，接种30 d后完全沉默即发生系统沉默，沉默率达到60.87％，其余8株始终未发生沉默。
含植物表达载体pGR-CH P6和pGR-CH△P6的农杆菌EHA105各接种2株转GFP基因16c本氏烟叶片，接种15 d后4株转GFP基因16c本氏烟全株都出现花叶症状，于紫外灯下观察，发现均未重新出现绿色荧光。
4.沉默信号传导试验的GFP荧光观察与Real-time PCR检测
以含植物表达载体pCAM-CH P6和pCAM-GFP的农杆菌EHA105，分别接种转GFP基因16c本氏烟的不同部位的叶片和相同叶片的不同部位。15 d后于紫外灯下观察16c顶端未浸润叶片是否出现沉默现象。结果发现，发现pCAM-CH P6接种上部叶片pCAM-GFP接种下部叶片和pCAM-CH P6接种叶片基部pCAM-GFP接种叶片尖部的植株顶端未浸润叶片都未出现沉默现象，pCAM-CH P6接种下部叶片pCAM-GFP接种上部叶片和pCAM-CH P6接种叶片尖部pCAM-GFP接种叶片基部的植株顶端未浸润叶片都出现沉默现象。
分别采样并提取各植株顶端未浸润叶片的总RNA，利用Real-time PCR技术检测GFP基因的转录水平。结果发现，GFP基因在pCAM-CH P6接种上部叶片、pCAM-GFP接种下部叶片和pCAM-CH P6接种叶片、基部pCAM-GFP接种叶片尖部的植株顶端未浸润叶片具有很高的转录水平，在pCAM-CH P6接种下部叶片、pCAM-GFP接种上部叶片和pCAM-CH P6接种叶片尖部、pCAM-GFP接种叶片基部的植株顶端未浸润叶片的转录水平很低。
草莓;镶脉病毒;P6蛋白;RNA沉默抑制子;基因沉默
安徽农业大学
硕士
植物病理学
江彤
2012
中文
S668.4
55
2012-11-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）